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Transcription in vitro, problème de contamination


J'utilise un ARN qui est transcrit in vitro avant de commencer mon projet. Il s'est avéré qu'il n'est pas préparé correctement et qu'il est contaminé par l'ADN.

Au lieu d'effectuer à nouveau la transcription in vitro, je veux essayer de la nettoyer avec un traitement à la DNase et une précipitation au LiCl par la suite. Pensez-vous que cela fonctionnerait?

Et deuxième chose, l'ARN transcrit in vitro est dans différentes dilutions, donc j'ai un peu de stock (peut-être 5 uL) qui est d'environ 200 ng/uL et j'ai d'autres dilutions 1 et 0,1 ng/uL. Je voudrais tous les nettoyer. Pensez-vous que si je mélangeais simplement toutes les dilutions avec le stock, que je déterminais la concentration et que je faisais le reste ? Est-ce approprié ?

Merci!


Le traitement à la DNase est en fait l'une des étapes facultatives si vous souhaitez vous débarrasser du modèle d'ADN d'origine : https://www.neb.com/protocols/2013/04/02/standard-rna-synchronous-e2050

Si vous savez, votre contamination s'est produite après la transcription, le traitement à la DNase devrait évidemment aider.

Concernant les aliquotes : votre stock est 200 fois plus concentré que les aliquotes (donc pour obtenir des quantités d'ARN égales à 1 µl du stock, il faudrait prendre 200 µl de l'aliquote de 1 ng/µl). Je ne pense pas que cela vaut la peine de les mélanger (et l'efficacité de la précipitation de l'ARN sera probablement diminuée), sinon faites simplement une autre transcription.


Chapitre 5 Dédénylation régulée In vitro

La queue 3′-poly(A), présente sur pratiquement tous les ARNm, est raccourcie enzymatiquement par un processus appelé « déadénylation ». La dédénylation est un moyen répandu de contrôler la stabilité et la traduction de l'ARNm. Les enzymes impliquées, appelées déadénylases, sont étonnamment diverses. Ils sont contrôlés par des séquences d'ARN communément trouvées dans les régions 3'-non traduites (UTR), qui se lient aux facteurs régulateurs.

Les protéines de liaison à l'ARN et les microARN accélèrent la déadénylation d'ARNm spécifiques. Dans certains cas, les régulateurs améliorent la déadénylation en se liant à et en recrutant des déadénylases spécifiques à l'ARNm cible. Les centaines de régulateurs potentiels codés dans les génomes des mammifères (à la fois les protéines de liaison à l'ARN et les microARN) et les nombreuses déadénylases, couplées aux nombreux sites régulateurs potentiels représentés dans les 3'UTR des ARNm, fournissent un terrain fertile pour la déadénylation régulée. Des études mondiales récentes sur la régulation poly(A) appuient cette conclusion. Des approches biochimiques et génétiques seront essentielles pour explorer la déadénylation régulée.

Les méthodes que nous décrivons se concentrent sur la reconstruction in vitro de déadénylation régulée avec des composants purifiés de levure. Nous discutons largement des stratégies, des problèmes et de l'histoire de in vitro systèmes de déadénylation. Nous combinons cela avec une discussion plus détaillée de la purification, de l'activité et de la régulation de la Saccharomyces cerevisiae Complexe d'adénylase Ccr4p‐Pop2p et sa régulation par les protéines de liaison à l'ARN PUF (Pumilio and Fem‐3 binding factor).


Production d'ARN pur et fonctionnel pour des expériences de reconstitution in vitro

La reconstitution de complexes protéiques a été un outil précieux pour tester les fonctions moléculaires et interpréter les observations in vivo. Ces dernières années, un grand nombre de complexes ARN-protéine ont été identifiés pour réguler l'expression des gènes et être importants pour une gamme de fonctions cellulaires. Contrairement aux complexes protéiques, les analyses in vitro des complexes ARN-protéine sont entravées par le fait que l'expression et la purification recombinantes des molécules d'ARN sont plus difficiles et moins bien établies que pour les protéines. Ici, nous passons en revue l'état actuel de la technologie disponible pour les expériences in vitro avec des ARN. Nous décrivons les possibilités de produire et de purifier de grandes quantités d'ARN homogène et d'effectuer les contrôles de qualité requis. Les problèmes spécifiques à l'ARN tels que la dégradation, l'hétérogénéité des extrémités 5' et 3', la coexistence de différents états de repliement et les conditions préalables à la reconstitution d'ARN avec des protéines exprimées de manière recombinante sont discutés. De plus, un certain nombre de techniques pour la caractérisation des interactions ARN-protéine directes et indirectes sont expliquées.

Mots clés: ARN Repliement de l'ARN Purification de l'ARN Qualité de l'ARN Interactions ARN-protéine Reconstitution de RNP.

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Systèmes de traduction

Lysat de réticulocytes de lapin
Le lysat de réticulocytes de lapin est un système de synthèse de protéines eucaryotes in vitro très efficace utilisé pour la traduction d'ARN exogènes (soit naturels, soit générés in vitro). In vivo, les réticulocytes sont des cellules hautement spécialisées principalement responsables de la synthèse de l'hémoglobine, qui représente plus de 90 % de la protéine fabriquée dans le réticulocyte. Ces globules rouges immatures ont déjà perdu leur noyau, mais contiennent un ARNm adéquat, ainsi qu'une machinerie de traduction complète, pour une synthèse étendue de la globine. L'ARNm de la globine endogène peut être éliminé par incubation avec une nucléase micrococcale dépendante du Ca2+, qui est ensuite inactivée par chélation du Ca2+ par EGTA. Ambion propose un lysat de réticulocytes traité à la nucléase. Ce type de lysat est le système acellulaire dépendant de l'ARN le plus largement utilisé en raison de son faible bruit de fond et de son utilisation efficace des ARN exogènes, même à de faibles concentrations (figure 1). Les protéines exogènes sont synthétisées à un rythme proche de celui observé dans les cellules de réticulocytes intactes.

Le lysat de réticulocytes non traité traduit l'ARNm de la globine endogène, les ARN exogènes ou les deux. Ce type de lysat est généralement utilisé pour étudier la machinerie de traduction, par ex. étudier les effets des inhibiteurs sur la traduction de la globine. Les lysats de réticulocytes de lapin non traités et traités ont une faible activité de nucléase et sont capables de synthétiser une grande quantité de produit de pleine longueur. Les deux lysats sont appropriés pour la synthèse de protéines plus grosses à partir d'ARN coiffés ou non coiffés (eucaryotes ou viraux).


Méthodes de purification

Précipitation et extraction par solvant

L'isolement sélectif de l'ARN à partir de mélanges complexes est une étape nécessaire dans la plupart des protocoles de purification pour obtenir une première, rugueux raffinement de l'échantillon avant des techniques de séparation plus sophistiquées. Les méthodes de précipitation et d'extraction par solvant tirent parti de la solubilité différentielle des biomacromolécules dans différents solvants et conditions ioniques. La précipitation est généralement effectuée après des réactions enzymatiques in vitro pour séparer l'ARN d'intérêt des composants protéiques et ADN ou simplement pour un échange de tampon, tandis que l'extraction par solvant suivie d'une précipitation est la méthode de choix pour isoler de grandes quantités d'ARN total à partir de sources naturelles. Voir pour une vue d'ensemble le tableau 2.

Précipitation

La nature polaire du squelette chargé négativement rend l'ARN très soluble dans l'eau. Plusieurs cations utilisés en combinaison avec de l'éthanol glacé comme co-solvant peuvent neutraliser efficacement les charges du squelette et réduire la solubilité à un point où l'ARN précipite sélectivement hors de la solution. Différents cations et leurs sels, tels que l'acétate d'ammonium et le chlorure de lithium, peuvent être utilisés en fonction de la taille et de la concentration de l'ARN à précipiter. Une méthode complète comprenant des protocoles étape par étape pour la précipitation de l'ARN peut être trouvée dans [93].

Extraction par solvant

L'isolement d'ARN par extraction acide de thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme a été initialement développé comme alternative à l'isolement fastidieux d'ARN total à partir de tissus de mammifères par ultracentrifugation. Dans cette méthode, l'échantillon est incubé avec un mélange équimolaire de phénol et de chloroforme, ce qui permet aux protéines d'être dénaturées par le thiocyanate de guanidinium et par conséquent séparées dans la phase organique, tandis que l'ARN est dissous dans la phase aqueuse. La séparation des deux phases est ensuite réalisée par centrifugation, et l'ARN peut être récupéré par précipitation ultérieure à l'éthanol ou au chlorure de lithium. Dans l'acide thiocyanate de guanidinium–phénol–chloroforme, la phase polaire est maintenue dans des conditions acides (pH 4–6), permettant à l'ARN de rester soluble tandis que l'ADN subit une répartition à l'interface. Une version détaillée et rééditée du protocole original a été publiée [94], et de nombreux kits commerciaux basés sur cette méthode sont disponibles.

Ultracentrifugation

L'ultracentrifugation est le moyen standard de purifier les grandes machines à ARN, telles que les ribosomes et les sous-unités ribosomiques, ainsi que d'autres macromolécules d'origine biologique dans la même gamme de taille. L'ultracentrifugation avec un gradient d'un soluté tel que le saccharose est utilisée depuis plus d'un demi-siècle [95]. Pour l'isolement de ribosomes complets, de polysomes ou de sous-unités ribosomiques individuelles, de grandes quantités de cellules de l'organisme d'intérêt sont lysées mécaniquement, le lysat est ensuite centrifugé à basse vitesse pour éliminer les débris cellulaires, puis ultracentrifugé à haute g (environ 10 5 g) sur un saccharose coussin pour former un culot des ribosomes requis [96]. Le matériau peut ensuite être purifié davantage par ultracentrifugation sur une variété de gradients de saccharose tamponnés avec différentes teneurs en sel. La capacité du ribosome à maintenir ses deux sous-unités ensemble dépend fortement du magnésium, et en ajustant la teneur en Mg 2+ du gradient de saccharose utilisé pour la purification, on peut obtenir des ribosomes complets ou des sous-unités individuelles. Une concentration plus faible en ions magnésium (1 mM) aidera à séparer les sous-unités individuelles, tandis qu'une concentration plus élevée favorisera l'isolement des ribosomes complets [97]. Après séparation des composants ribosomiques, l'absorbance UV du contenu des tubes de centrifugation est mesurée et le contenu est fractionné. A partir des profils d'absorbance, la teneur en fraction peut être déduite [96]. Bien que traditionnellement largement utilisée dans le domaine de la biologie structurale en cristallographie aux rayons X et cryo-EM, la technique d'ultracentrifugation a également trouvé sa place dans d'autres domaines de recherche. De multiples méthodes où les ribosomes sont isolés pour l'étude de l'ARN messager traduit à un moment précis, le traducteur, utilisent également la technique d'ultracentrifugation [98, 99]. L'ultracentrifugation s'est également avérée utile pour la nanotechnologie liée aux acides nucléiques ou ADN origami, où l'ultracentrifugation sur des gradients de glycérol a été utilisée comme un bon complément aux méthodes de purification par électrophorèse sur gel d'agarose plus conventionnelles et établies [100].

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

Pendant des décennies, l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) était la méthode standard pour purifier de grandes quantités d'ARN (à l'échelle du microgramme au milligramme) avec une résolution d'un seul nucléotide car elle peut être facilement appliquée à une large gamme de tailles d'ARN et nécessite une configuration minimale avec un coût -réactifs efficaces. Comme toutes les techniques électrophorétiques, PAGE utilise un maillage polymère pour séparer les molécules par taille et/ou conformation, lorsque les macromolécules chargées migrent à travers un champ électrique. Le treillis est préparé par polymérisation d'une solution acrylamide/bisacrylamide. Les concentrations de monomères acrylamide/bisacrylamide peuvent être modifiées pour obtenir la taille de pores et le pouvoir de résolution souhaités dans le maillage final. Les concentrations de monomères typiques vont de 5 % à 20 % pour les gels d'ARN avec un rapport relatif acrylamide/bisacrylamide de 1:19. Dans cette gamme, les ARN de longueur courte à intermédiaire (5 à 500 nucléotides) peuvent être résolus [101]. La solution d'acrylamide peut être additionnée d'un agent dénaturant (le plus souvent de l'urée 8 M, appelée « PAGE dénaturante ») pour déplier complètement l'ARN en migration et séparer les molécules uniquement par taille. Avec cette approche, la résolution d'un seul nucléotide peut être facilement obtenue dans des préparations à grande échelle, et c'est une méthode analytique courante. Lorsqu'aucun agent dénaturant n'est utilisé et que l'appareil d'électrophorèse est refroidi de l'extérieur pour éviter la surchauffe causée par le courant électrique circulant à travers le gel, les conformères avec des rayons hydrodynamiques différents d'une construction d'ARN donnée peuvent être résolus. 102]. L'isolement de l'ARN d'intérêt est obtenu par excision de la bande d'intérêt du gel, suivie d'une électroélution ou d'une extraction par écrasement et trempage [103]. L'excision au gel est couramment utilisée et ne nécessite qu'une lampe UV pour identifier la bande d'intérêt par ombrage UV sur du papier fluorescent et un scalpel pour exciser la bande. La bande excisée est ensuite traitée pour permettre la diffusion de l'ARN du maillage de gel dans la solution, et l'ARN est ensuite purifié par précipitation à l'éthanol et remis en suspension dans un tampon de choix. L'impact de l'ombrage UV sur l'intégrité de l'ARN a récemment été abordé, révélant que les lampes et les temps d'exposition couramment utilisés peuvent entraîner des dommages photo minimes mais détectables de l'échantillon, et ainsi potentiellement corrompre les études structurelles en aval [104]. L'électroélution nécessite un appareil dédié qui permet la collecte des espèces correspondant à la bande d'intérêt éluée des morceaux de gel. La PAGE préparative d'ARN est utilisée depuis des décennies et son utilisation a été bien décrite dans les manuels.

Chromatographie liquide

Les techniques de chromatographie liquide sont bien établies pour la purification et l'analyse d'acides nucléiques et d'oligonucléotides couvrant une large gamme de tailles. Sur la base du concept de permettre aux solutés dans un solvant (phase mobile) de traverser une colonne contenant un matériau solide (phase stationnaire) qui interagit avec les solutés dans une mesure différente, la séparation est réalisée [106]. Ici, nous nous concentrons sur les méthodes chromatographiques qui sont pertinentes pour la préparation des échantillons d'ARN (Fig. 4). Parmi les techniques de séparation par sorption couramment utilisées pour la séparation des acides nucléiques figurent la HPLC par appariement d'ions en phase inverse (RP-IP-HPLC), la HPLC par échange d'ions (IE-HPLC) et la chromatographie liquide à haute performance avec échange d'ions (IE-FPLC ) [107]. Dernièrement, les méthodes de chromatographie d'affinité, entrant dans la catégorie des techniques de sorption, ont été de plus en plus utilisées pour la préparation d'ARN. En outre, il existe des exemples d'approches réussies de purification d'ARN utilisant la chromatographie d'exclusion de taille (SEC), où les molécules sont séparées sur la base de la taille moléculaire plutôt que des interactions chimiques avec la phase stationnaire [106]. Toutes ces techniques et leur pertinence pour la préparation d'échantillons d'ARN ont été récemment revues [46, 108, 109, 110, 111]. Une description plus détaillée des différentes méthodes suit.

Méthodes de chromatographie liquide. une Chromatographie d'appariement d'ions en phase inverse la phase stationnaire lipophile retient l'ARN grâce à un agent d'appariement de cations lipophiles (le tétrabutylammonium est représenté). b Chromatographie par échange d'ions, une phase stationnaire chargée positivement interagit et retient les molécules d'ARN chargées négativement. c Chromatographie d'affinité, une phase stationnaire fonctionnalisée polyuridine (poly(U)) interagit sélectivement avec les queues polyadénosine (poly(A)) des ARN messagers (ARNm). Chromatographie d'exclusion stérique, les gros ARN sont élués à travers le milieu poreux de la phase stationnaire avec des temps de rétention courts, et les ARN plus petits sont absorbés dans le milieu poreux, ce qui entraîne des temps de rétention plus longs

Chromatographie liquide haute performance par appariement d'ions en phase inversée

Cette technique est basée sur l'utilisation de cations lipophiles composés d'ammonium quaternaire qui s'apparient avec le squelette sucre-phosphate chargé négativement de l'oligonucléotide. Ces complexes à paires d'ions deviennent alors lipophiles et peuvent interagir avec la phase stationnaire d'une colonne de chromatographie en phase inverse (Fig. 4a). Le complexe oligonucléotidique lipophile, une fois lié à la colonne, est élué et séparé avec un gradient de solvant organique, généralement avec de l'acétonitrile [107]. Comme décrit précédemment [108, 109], bien que la RP-IP-HPLC ait été utilisée avec succès pour la séparation d'oligonucléotides depuis près de 40 ans pour de plus petites quantités de matériel (échelle analytique), la mise à l'échelle de la méthode est rare (échelle préparatoire). Des exemples de méthodes d'appariement d'ions en phase inverse, purifiant de plus grandes quantités d'oligonucléotides, à l'échelle préparative d'environ 1 mg peuvent être trouvés [112, 113], mais pour ces exemples et des exemples similaires, le matériel purifié est exclusivement constitué d'oligonucléotides synthétiques, qui sont déjà intrinsèquement pur. Les méthodes RP-IP-HPLC sont couramment développées à des fins analytiques [114, 115]. Certains travaux récents à l'échelle analytique pourraient également s'appliquer à la préparation d'échantillons d'ARN : par exemple, la RP-IP-HPLC a été utilisée pour analyser et purifier l'ARN double brin (ARNdb) à partir de matériel exprimé dans E. coli [116]. Dans ce travail, l'ARN total a été extrait des bactéries et analysé par RP-IP-HPLC. On a profité du fait que l'ARN simple brin peut être ultérieurement dégradé pour isoler l'ARNdb. Cette méthode illustre la facilité d'utilisation de RP-IP-HPLC pour évaluer la présence et la pureté de l'ARNdb ainsi que l'ARN natif de la cellule (par exemple, la séparation des ARNt et des différents ARN ribosomiques). Une autre méthode concerne la séparation des stéréoisomères pour produire synthétiquement des ARN contenant des groupes phosphorothioate dans le squelette par RP-IP-HPLC [117]. Ce travail montre qu'il est possible de séparer les stéréoisomères en utilisant des produits chimiques classiques d'appariement d'ions en phase inverse et des agents d'appariement d'ions. L'acétate de triéthylamine en combinaison avec le modificateur organique acétonitrile était la combinaison la plus réussie.

Chromatographie liquide haute performance échangeuse d'ions

Tout comme la méthode RP-IP-HPLC, IE-HPLC et IE-FPLC sont également établies comme technique de séparation des oligonucléotides. Dans cette technique, la phase stationnaire contient déjà les groupes cationiques avec lesquels l'oligonucléotide anionique interagit et se lie (Fig. 4b). Le polymère est ensuite élué et séparé sur colonne à l'aide d'un gradient de sel [107]. L'IE-HPLC a été utilisée avec succès dans le domaine de la biologie structurale de l'ARN, et l'IE-FPLC [109, 118] pourrait être l'une des options les plus intéressantes pour purifier des quantités de milligrammes d'ARN transcrit in vitro. Cependant, même avec cette méthode, des transcrits abortifs peuvent être présents dans le matériel purifié final pour des molécules plus courtes que 30 nucléotides lorsque l'on part d'un échantillon d'ARN hétérogène. IE-HPLC a également été utilisé avec succès avec trans-des ribozymes en tête de marteau agissant (voir « Clivage du ribozyme et ligature de T4 ») pour purifier l'ARN transcrit in vitro à l'échelle du milligramme [62]. Le fait que le ribozyme soit trans-acting peut rendre cette approche attrayante pour purifier des échantillons d'ARN marqués isotopiquement, puisque le ribozyme de clivage peut être transcrit sans être marqué dans une réaction de transcription complètement indépendante. Plusieurs aspects importants de l'IE-HPLC ont été examinés concernant la manière dont différents cations supportent différents conformères d'ARN qui influencent ensuite la séparation IE-HPLC [119].

Techniques de chromatographie d'affinité

Comme indiqué précédemment, la technique de chromatographie d'affinité entre dans la catégorie des techniques de sorption, c'est-à-dire que le composé à séparer interagit chimiquement avec la phase stationnaire (Fig. 4c). La différence majeure par rapport à la chromatographie échangeuse d'ions et à la chromatographie en phase inverse est que le mode d'interaction entre l'analyte et la phase stationnaire est fortement spécifique et s'inspire souvent d'interactions biologiques [120]. Le type de molécules en phase stationnaire, les ligands d'affinité, qui interagissent avec la molécule à séparer en phase mobile, peuvent être très différents : anticorps, protéines, oligonucléotides, colorants, groupements boronates, ou ions métalliques chélatés sont fixés sur un solide support tel que des billes d'agarose ou un matériau de silice et constituent la phase stationnaire [121]. Cette polyvalence des phases stationnaires a conduit à un certain nombre d'approches différentes de purification d'ARN, dont certaines ont été revues récemment [111]. A moins que l'ARN à purifier ne contienne naturellement une séquence à forte affinité pour une cible pouvant être immobilisée sur la phase stationnaire, l'ARN peut être tagué avec une séquence spécifique pour le faire, analogue à l'étiquette polyhistidine utilisée en science des protéines. Il existe plusieurs façons d'y parvenir. Les tags d'affinité peuvent être développés par évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) [122]. Une approche a développé des séquences d'ARN liant la streptavidine et le Sephadex. L'ARN marqué a été élué du ligand d'affinité par liaison compétitive du ligand naturel d-biotine ou dextrane [123]. Dans une autre approche élégante, le marqueur peut être combiné avec un ribozyme activé par un composé pour cliver le produit d'intérêt de la phase stationnaire [124].

Chromatographie d'exclusion stérique

Comme son nom l'indique, la séparation SEC est basée sur la différence de taille ou de rayon hydrodynamique des molécules. Lorsqu'une phase stationnaire poreuse est utilisée, les grosses molécules ne peuvent pas entrer dans les pores et elles traversent la phase stationnaire, tandis que les molécules plus petites sont retenues (Fig. 4d). Sur la base de ce principe, la séparation est réalisée et les molécules les plus grosses sont éluées en premier [106]. Les systèmes SEC ont été utilisés avec succès pour la préparation d'échantillons d'ARN à l'échelle préparatoire [125, 126]. Des effets importants de la structure de l'ARN, tels que l'influence de la structure secondaire des oligonucléotides et son influence sur les séparations SEC, ont été étudiés [127]. Pour les oligonucléotides phosphorothioates, les propriétés de séparation SEC ont récemment été étudiées [128]. Ce travail a conclu que les oligonucléotides phosphorothioates peuvent être séparés efficacement par SEC bien que cela soit compliqué par une lipophilie supplémentaire causée par les atomes de soufre dans le squelette de l'oligonucléotide.


Notions de base sur la transcription in vitro

La transcription in vitro utilise l'ARN polymérase ADN dépendante du bactériophage telle que l'ARN polymérase T7, T3 ou SP6 pour synthétiser l'ARN à partir d'une matrice d'ADN. L'ADN matrice pour les réactions de transcription in vitro comprend un promoteur d'ARN polymérase en amont de la séquence d'intérêt. L'ARN polymérase correspondante est ensuite utilisée pour produire des transcrits d'ARN synthétiques à utiliser comme sondes d'hybridation, comme matrices pour des applications de traduction in vitro, ou dans des études structurelles (cristallographie aux rayons X et RMN). Les transcrits d'ARN synthétisés sont également utilisés pour étudier la fonctionnalité de l'ARN cellulaire dans des processus tels que l'épissage, le traitement de l'ARN, le transport intracellulaire, l'infectivité virale et la traduction.


LE FINANCEMENT

Financement des frais de libre accès : les frais de publication en libre accès pour cet article ont été supprimés par Oxford University Press - les membres du comité de rédaction de NAR ont droit à un article gratuit par an en reconnaissance de leur travail au nom de la revue.

Déclaration de conflit d'intérêts. Aucun déclaré.

Adresse actuelle : Sonja Petkovic, Institut für Molekulare Medizin, UK S-H, Campus Lübeck, Universität zu Lübeck, Ratzeburger Allee 160, 23538 Lübeck, Allemagne.


MICROPROPAGATION & LE RLE DU GÉLIFICATEUR

Organisateurs : Barbara M. Reed, USDA, Valerie C. Pence, Cincinnati Zoo and Botanical Gardens, et Michael J. Bosela, Indiana University-Purdue University à Fort Wayne

13h30 – 15h00
Symposium sur les plantes Grand 1

Le rôle des agents gélifiants dans la réponse des plantes et des cellules en culture est souvent négligé. Ce symposium explorera les effets des différents types d'agents gélifiants sur la micropropagation et la régénération. Outre des effets évidents sur la disponibilité de l'eau et la dureté du support, les gélifiants peuvent affecter la disponibilité des nutriments et dans le cas de la gélose, les fractions non gélifiantes du produit (agaropectine, alginate, etc.) peuvent influencer la morphogenèse des plantes. Cette session fournira également des informations de base sur la chimie des agents gélifiants, y compris une évaluation de leurs besoins en pH et en sel, et discutera des problèmes de variabilité des produits à la fois entre les fabricants et les lots.

1:30 Introduction (B. M. Reed, V. C. Pence et M. J. Bosela)
1:35 P-4 L'ABC des gels de polysaccharides
Rengaswami Chandrasekaran
, Purdue Université Whistler Centre pour la recherche sur les glucides
2:00 P-5 Modification de l'agent gélifiant pour la multiplication des pousses axillaires à grande échelle et l'embryogenèse somatique de Pinus radié pour la foresterie commerciale
Dale Smith,Méta-génétique
2:25 P-6 Examen des agents gélifiants utilisés pour la culture de tissus végétaux : leurs sources et leurs caractéristiques
Ken Torres, PhytoLaboratoires technologiques
2:50 Discussion


Amplification isotherme d'ADN in vitro : le système d'amplification hélicase-dépendante

Depuis le développement de la réaction en chaîne par polymérase, l'amplification des acides nucléiques est devenue un outil élémentaire pour la biologie moléculaire, la génomique et la biotechnologie. Les méthodes d'amplification utilisent souvent des cycles de température pour amplifier de façon exponentielle les acides nucléiques. Cependant, des méthodes d'amplification isotherme ont également été développées, qui ne nécessitent pas de chauffer l'acide nucléique double brin pour dissocier les produits synthétisés des matrices. Parmi les différentes méthodes utilisées pour l'amplification isotherme de l'ADN, l'amplification dépendante de l'hélicase (HDA) est discutée dans cette revue en mettant l'accent sur le système de réplication de l'ADN reconstitué. Étant donné que l'ADN hélicase peut dérouler l'ADN double brin sans avoir besoin de chauffage, le système HDA fournit un outil très utile pour amplifier l'ADN in vitro dans des conditions isothermes avec un schéma de réaction simplifié. Cette revue décrit les composants et les aspects détaillés des systèmes HDA actuels utilisant Escherichia coli UvrD hélicase et T7 bactériophage gp4 hélicase en tenant compte de la processivité et de l'efficacité de l'amplification de l'ADN.

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COMMENTAIRE

Informations d'arrière-plan

Les protocoles présentés dans cet article sont basés sur des méthodes de production d'échantillons publiées précédemment par notre groupe (Feyrer et al., 2020 Karlsson et al., 2020). Ils sont une consolidation des avancées précédentes de la production d'ARN avec T7 IVT et sont rassemblés dans un protocole cohérent et robuste. Nous décrivons en outre comment concevoir un fragment d'ARN, qui devrait préserver la structure d'un ARN biologique plus grand pour les études structurelles (Fig. 1). Cette approche compare la structure simulée du plus grand ARN natif à celle du fragment d'intérêt à produire. Les simulations sont réalisées avec le logiciel MC-Fold, car il prend en compte les paires de bases non canoniques. Une inférence sur la stabilité thermodynamique et l'ensemble conformationnel des deux constructions d'ARN peut être faite en analysant les structures simulées sur une large gamme d'énergie (Fig. 2). En utilisant cette approche, la probabilité d'un repliement correct du fragment d'ARN produit peut être augmentée avant de commencer la production de l'échantillon.

Malgré les nombreux avantages de l'approche décrite, la méthode présente un certain nombre de limitations. La prédiction de la structure secondaire ne peut pas garantir un repliement exact, laissant une certaine incertitude et la nécessité d'un sondage plus poussé de la structure. De plus, même avec l'introduction de séquences 5'-GG ou en utilisant l'approche de transcription en tandem, la dépendance de séquence ne peut pas être totalement éliminée, ce qui donne lieu à une certaine variation de rendement entre les différentes constructions d'ARN. De plus, l'étape HPLC RP-IP réduit l'usure de la colonne IE mais ajoute plus de temps au protocole et peut même entraîner une perte de produit. Tout au long des protocoles, nous avons systématiquement suggéré l'utilisation de gels de polyacrylamide colorés au bromure d'éthidium. Malgré les dangers bien connus de ces produits chimiques pour la santé et le fait que des alternatives plus modernes telles que la série de colorants d'acides nucléiques SYBR ® soient désormais disponibles, nous avons choisi le bromure d'éthidium pour la coloration en raison de sa robustesse et de sa facilité d'utilisation. Une discussion détaillée sur l'utilisation du bromure d'éthidium a été menée (Karlsson et al., 2020). Cependant, les protocoles de coloration utilisant des colorants différents offrent une sensibilité similaire et ne limitent pas l'applicabilité du protocole.

Paramètres critiques

Construire et séquencer la conception

La performance de la réaction de transcription T7 dépendra de la séquence de l'ARN à transcrire. Comme mentionné dans le protocole de base 1, une séquence commençant par un 5'-GG se transcrira mieux (Price et al., 1995). Comme souligné dans le protocole de base 1, il est important de considérer le comportement de repliement des produits de suppression et d'addition possibles. Même si les protocoles décrits ici se traduiront par des fractions finales de haute pureté, des produits de suppression et d'addition peuvent être présents dans une certaine mesure.

Conception de guide de clivage

La transcription en tandem excelle par rapport à l'IVT classique car la RNase H produit des sites de clivage plus précis que la polymérase T7 ne produit des extrémités 5' et 3' définies. Par conséquent, le clivage hors cible dû à une liaison non spécifique du guide de clivage est préjudiciable à la méthode. Dépistez la séquence pour les correspondances complémentaires du fragment d'ADN central et dans les régions flanquantes. Nous n'avons pas rencontré ce problème cependant, Duss, Maris, von Schroetter et Allain (2010) ont mentionné que l'extension des flancs peut augmenter la spécificité en cas de clivage hors cible ou incomplet.

Optimisation de la transcription in vitro

L'objectif des étapes d'optimisation de l'IVT (Protocole de base 2 étapes 8 à 11) est de maximiser le rendement du transcrit d'ARN par rapport à la quantité/le coût des réactifs. Dans les protocoles décrits ici, lorsque l'électrophorèse analytique sur gel avec coloration au bromure d'éthidium et éclairage UV est utilisée pour l'évaluation de la réaction, il est important de ne pas surinterpréter les résultats du gel. C'est-à-dire qu'il faut garder à l'esprit que des variations de concentration assez importantes peuvent donner lieu à des bandes d'apparence similaire sur un gel coloré, en fonction de la précision du chargement, de l'efficacité de la coloration et des produits secondaires. Une fois qu'une condition permet une transcription claire et entraîne des bandes intenses sur le gel, choisissez cette condition, surtout si elle nécessite de plus petites quantités de réactifs coûteux.

Clivage de la RNase H

Dans le cas d'une IVT en tandem réussie, tout le transcrit peut être clivé en ARN cible de pleine longueur, ne laissant que les régions d'espacement 5' et 3', contenant respectivement la séquence d'initiation et le résidu du site de restriction. Aucune espèce de poids moléculaire plus élevé ne doit être visible sur une PAGE analytique.

Système HPLC

Pour un résultat réussi des protocoles, il est important que le système HPLC soit correctement équilibré. Si les colonnes HPLC sont correctement équilibrées, la reproductibilité entre les injections est généralement élevée et les régions des chromatogrammes dans lesquelles le transcrit principal élue sont presque identiques entre les injections si des quantités égales sont injectées.

Routines de travail sans RNase

Tout au long de toutes les étapes du protocole, il est important de s'assurer que le système HPLC et l'équipement de laboratoire pour l'IVT, les étapes d'échange de tampon et d'autres étapes sont exempts de RNases. La meilleure façon de s'en assurer est, en plus des routines techniques stériles ordinaires (par exemple, de l'éthanol, des gants), de nettoyer les espaces de travail et l'équipement avec de l'éthanol à plus de 95 % et des produits d'élimination de la RNase tels que RNaseZap.

Électrophorèse analytique sur gel (PAGE)

Les fractions HPLC dans les protocoles de base 3 et 4 sont analysées par électrophorèse analytique sur gel. Ce qu'il est important de prendre en compte lors de la coloration sur gel des fractions HPLC, ce sont les effets de dilution de l'utilisation de la HPLC et le fait que les transcrits de contaminants peuvent être mal visibles sur un gel à partir d'une fraction HPLC, mais une fois regroupés et concentrés dans un échantillon final, ils peuvent apparaître plus clairement. . It is important to keep this in mind when choosing fractions to pool for further processing.

Troubleshooting

Table 2 outlines some common problems that users may encounter when following the protocols, their likely causes, and potential solutions.

Problème Possible reason Solution
Poor or no transcription (standard IVT) Erroneous transcription reaction stock solutions RNA degradation RNase contamination unsuitable reaction conditions failed DNA template annealing Prepare new stock solutions of reactants change reaction conditions test enzyme of other supplier check DNA template on gel for correct size and purity run IVT reaction that has worked before as a positive control consider tandem IVT
Poor or no transcription (plasmid IVT) As above for standard IVT unsuccessful linearization Test linearization on agarose gel
Incomplete RNase H cleavage Cleavage guide or RNase H concentration too low or time too short Heat to 95°C for 2 min and cool slowly add more iPPase and RNase H for 1 hr
Small peak in chromatogram loss of material during concentration steps Leakage through concentrator membrane during concentration steps Check A260 of concentrator flow-through use concentrator filter unit for shorter time ensure acetonitrile content is below limit specified by manufacturer
Gel contains unexpected bands when loading concentrated material HPLC purifications dilute the RNA material, so when loading a fraction contaminant bands might be poorly visible on gel Consider possible dilution effects when analyzing HPLC fractions and choosing fractions to pool together as sample
Nonhomogeneous migration of bands on gel Temperature differences within gel during running high salt content Fill gel apparatus with water to even out temperature within gel clean gel wells quickly before loading
RNA does not bind to HPLC column Column is poorly equilibrated HPLC buffer system is erroneous Re-equilibrate column expose column to larger amount of eluting buffers check HPLC buffers
Retention time shift RNA elutes in wrong part of gradient Column is poorly equilibrated HPLC buffer system is erroneous Re-equilibrate column expose column to larger amount of eluting buffers check HPLC buffers clean HPLC system
  • A260, absorbance at 260 nm HPLC, high-performance liquid chromatography iPPase, inorganic pyrophosphatase IVT, in vitro transcription.

Understanding Results

The ultimate goal of the protocols described here is to obtain an RNA sample of high enough purity for the user's needs. One starts with creating a suitable sample that contains the region of interest (Basic Protocol 1) as shown in Figure 1. An example of how to evaluate the selection of the correct construct is shown in Figure 2. This is a flexible protocol, with options to use different protocols for RNA transcription (Basic Protocol 2 and Alternate Protocol). Use of Basic Protocol 4 or a combination of Basic Protocols 3 and 4 offers additional flexibility and the possibility to produce even poorly transcribing RNA with high yield and purity. The examples provided in Figures 3, 5, and 6 show gels and chromatograms from the optimization and purification of a 29mer RNA, which ultimately had a yield of 5.6%, corresponding to 1.8 mg of RNA material. Figure 3 demonstrates the impact of reactant concentration on transcription performance (e.g., increasing DMSO suppresses transcription, resulting in reduced band intensity). This figure therefore indicates the need for optimization of reaction conditions in Basic Protocol 2 and shows how to elucidate and interpret the results thereof. The Alternate Protocol, on the other hand, does not require such an optimization as the template size allows for a sequence-independent IVT.

Figure 5 illustrates the purity distribution of HPLC fractions from the RP-IP purification procedure described in Basic Protocol 3. The red line in Figure 5B indicates fractions under the target peak in the chromatogram in Figure 5A. The main band, representing the target, is enriched compared with the complete IVT mixture however, shorter and longer products are still present. As these fractions will have reduced concentrations of side products and IVT reactants, a more efficient preparation can be achieved in Basic Protocol 4. Finally, Figure 6B shows pure HPLC fractions the user can obtain by following Basic Protocols 3 and 4 together. Figure 6C shows both the final pure and less pure RNA fractions that have been combined and analyzed at high concentration by denaturing PAGE to visualize how abundant side products in the final material are. The 29mer sample—exemplified in Figures 3, 5, and 6—was transcribed with RNA with a 5′-GG, which increased the overall yield. It is also possible to purify longer RNAs with this method (Karlsson et al., 2020 ).

Time Considerations

We estimate that sequence design and IVT optimization (Basic Protocols 1 and 2) can be done in 5 working days, not considering delivery time of DNA templates (oligos or plasmids). Workup and RP-IP purification (Basic Protocol 3) of a large-scale (∼10-ml) transcription reaction could be done in 2 to 3 working days, and a similar amount of time could be estimated for Basic Protocol 4. An estimate of the total time from large-scale transcription reaction to final sample is thus around 1 week. Bacterial amplification of plasmids requires ∼3 days. Once enough plasmid has been purified, the Alternate Protocol and Basic Protocol 4 together can be done in 4 days from the linearization reaction to obtaining pure and clean RNA product.

Remerciements

The authors thank the Swedish Foundation for Strategic Research (project no. ICA14-0023 and FFL15-0178), the Swedish Research Council (2014-04303 and 2018-00250), the Ragnar Söderberg Foundation (M91/14), the Karolinska Institutet (KI FoAss and KID 2-3707/2013), and the Department of Medical Biochemistry and Biophysics (for support for the purchase of a 600-MHz Bruker NMR spectrometer). The authors thank the protein science facility (PSF) at the Karolinska Institutet for expression and purification of T7 RNA polymerase and E. coli RNase H and Martin Hällberg for the generous gift of the inorganic phosphatase. The authors also thank Andrea Coulthard Sørensen for contributing during the IVT optimization of the 29mer RNA exemplified in Figure 3.

Contributions d'auteur

Hampus Karlsson: conceptualization, data curation, investigation, methodology, writing–original draft, writing–review and editing. Hannes Feyrer: conceptualization, data curation, investigation, methodology, writing–original draft, writing–review and editing. Lorenzo Baronti: conceptualization, data curation, investigation. Katja Petzold: conceptualization, investigation, methodology, project administration, resources, supervision, writing–review and editing.

Conflict of Interest

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.


Voir la vidéo: La Fecundación in vitro explicada con sencillez (Janvier 2022).