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Comment filtrer les chaînes légères des anticorps en types kappa et lambda sur le site Web de PDB ?

Comment filtrer les chaînes légères des anticorps en types kappa et lambda sur le site Web de PDB ?



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Les chaînes légères d'anticorps peuvent être de type kappa ou lambda. Je recherche des séquences homologues sur le site du RCSB PDB. Existe-t-il un moyen de filtrer ces deux types?


Les instructions sont les suivantes.

  1. Rendez-vous sur le site Web du RCSB PDB.
  2. Sous la barre de recherche, cliquez surParcourir par annotations.
  3. Cliquez sur l'onglet bleu intituléSCOP.
  4. Cliquez sur la flèche blanche à côté du dossier intitulé Tous les bêta-protéines.
  5. Cliquez sur la flèche blanche à côté du dossier intitulé Sandwich bêta de type immunoglobuline (… ).
  6. Cliquez sur la flèche blanche à côté du dossier intitulé Immunoglobulines (Superfamille).

C'est là qu'il se divise, en fonction de votre recherche spécifique.

Pour la chaîne légère, domaine constant :

  1. Cliquez sur la flèche blanche à côté du dossier intitulé Domaines d'ensemble C1 (anticorps de type domaine constant).
  2. Pour le type Kappa, cliquez sur le dossier (pas la flèche) intitulé Domaine constant kappa de chaîne légère d'immunoglobuline, CL-kappa.
  3. Pour le type Lambda, cliquez sur le dossier (pas la flèche) intitulé Domaine constant lambda de chaîne légère d'immunoglobuline, CL-lambda.

Pour la chaîne légère, domaine variable :

  1. Cliquez sur la flèche blanche à côté du dossier intitulé Domaines de l'ensemble V (domaine variable de type anticorps).
  2. Pour le type Kappa, cliquez sur le dossier (pas la flèche) intitulé Domaine variable kappa des chaînes légères des immunoglobulines, VL-kappa (… ).
  3. Pour le type Lambda, cliquez sur le dossier (pas la flèche) intitulé Domaine variable lambda de chaîne légère d'immunoglobuline, VL-lambda (… ).

Cela devrait vous amener à la liste des protéines que vous recherchez.


Détection des bandes oligoclonales IgG kappa et IgG lambda dans le liquide céphalo-rachidien et le sérum avec des anticorps Hevylite™. comparaison avec le modèle oligoclonal à chaînes légères libres

Les bandes oligoclonales d'IgG dans le liquide céphalo-rachidien absentes dans le sérum indiquent une synthèse intrathécale d'IgG et sont un marqueur sensible des maladies inflammatoires du SNC, en particulier de la sclérose en plaques. Il peut être intéressant de déterminer si ces bandes sont majoritairement IgGκ ou IgGλ.

Méthodes

Nous avons utilisé des anticorps Hevylite™ et développé une technique de détection des bandes oligoclonales IgGκ et IgGλ par focalisation isoélectrique suivie d'un immunoblot. La même technique a été utilisée pour la détection oligoclonale libre κ et libre λ. Parmi plusieurs techniques testées, l'immunotransfert d'affinité semble être la plus sensible car elle permet de détecter moins de 1 ng de paraprotéine IgGκ ou IgGλ. Nous avons comparé les profils d'IgG oligoclonales avec ceux des IgGκ et IgGλ oligoclonales. Il y avait un bon accord concernant la présence ou l'absence de synthèse intrathécale. Nous avons observé les ratios entre les bandes oligoclonales IgGκ et IgGλ, et ils ne correspondaient pas toujours aux ratios entre les bandes κ libres et λ libres. Nous avons également pu détecter des bandes d'IgGκ et d'IgGλ oligoclonales restreintes au LCR spécifiques à l'antigène dans la neuroborréliose. Il reste à déterminer ultérieurement par une étude prospective à orientation clinique, si des IgGκ/IgGλ à prédominance ou des κ libres/λ libres peuvent être observés plus fréquemment dans des pathologies particulières à synthèse d'IgG oligoclonales.

Discussion

La détection très sensible des bandes oligoclonales IgGκ et IgGλ dans le liquide céphalo-rachidien avec des anticorps Hevylite est également possible. Dans des situations particulières, par ex. lorsque des difficultés surgissent pour distinguer le schéma oligoclonal du schéma monoclonal, le test peut avoir une valeur clinique considérable.


2.2. L'identification des protéines monoclonales sériques

Parallèlement aux observations cliniques et scientifiques du rôle de la protéine de Bence Jones, les techniques électrophorétiques de séparation des protéines évoluent et finissent par entrer dans les laboratoires cliniques. Perlzweig et al. [56] ont été les premiers à rapporter une hyperprotéinémie dans le MM en 1928. Peu de temps après, en 1930, Tiselius a rapporté l'homogénéité de certaines globulines sériques en utilisant une technique qu'il a conçue, appelée électrophorèse des limites mobiles.


Diagnostic

Les tests de diagnostic de l'amylose AL comprennent des analyses de sang, des analyses d'urine et des biopsies. Des tests sanguins et/ou urinaires peuvent indiquer des signes de la protéine amyloïde, mais seuls des tests de moelle osseuse ou d'autres petits échantillons de biopsie de tissus ou d'organes peuvent confirmer positivement le diagnostic d'amylose. Certains tests ne sont effectués qu'une seule fois pour établir un diagnostic d'amylose AL, tandis que d'autres seront répétés pour surveiller la progression de la maladie et la réponse au traitement.

Analyses de sang et d'urine

Des analyses de sang et d'urine doivent être effectuées pour aider à vérifier le diagnostic. Ils peuvent également aider à découvrir quels organes sont impliqués et à quel point ils sont compromis. Ces tests peuvent inclure :

  • Une collecte d'urine de 24 heures pour examiner le niveau de protéines dans votre échantillon d'urine. Un excès de protéines dans l'urine peut être une indication d'une atteinte rénale.
  • Le niveau d'ALP (une enzyme appelée « phosphatase alcaline ») dans votre bilan sanguin régulier.
  • Les tests sanguins pour rechercher le stress et la pression sur le cœur sont utiles dans de nombreuses formes de maladie cardiaque, y compris l'amylose AL. Les biomarqueurs cardiaques utilisés comprennent la troponine T ou la troponine I, et le NT-proBNP (qui signifie N-terminal pro-brain natriuretic peptide) ou BNP (brain natriuretic peptide). Différents laboratoires utilisent l'un par rapport à l'autre.
  • Les tests pour les protéines anormales d'anticorps (immunoglobulines) dans le sang comprennent le test Freelite, qui montre le niveau de chaînes légères kappa et lambda dans un test sanguin séparé. Le test Freelite Assay est souvent appelé FLC, qui est l'abréviation de chaînes légères libres.
  • Un autre test d'immunoglobuline anormale peut être effectué avec du sang et/ou de l'urine. C'est ce qu'on appelle l'électrophorèse d'immunofixation.

Ces tests sanguins et urinaires peuvent aider au diagnostic et sont souvent utilisés lors de la surveillance de la réponse au traitement.

Échocardiogramme et imagerie

L'échocardiogramme (également appelé « écho ») est une échographie du cœur. Un médecin peut rechercher des dépôts amyloïdes dans le cœur, tout en observant la taille et la forme de celui-ci, ainsi que l'emplacement et l'étendue de tout impact de l'amyloïde.

Récemment, d'autres tests d'imagerie cardiaque se sont également révélés utiles. L'un des tests est l'IRM (imagerie par résonance magnétique) et, dans ce cas, est également appelé CMR (pour résonance magnétique cardiaque). La scintigraphie au pyrophosphate, un test de médecine nucléaire, est également utilisée pour évaluer si un type inhabituel d'anomalie de la fonction du muscle cardiaque (cardiomyopathie) est présent. Les données actuelles suggèrent que cette analyse peut être utile pour distinguer différents types de cardiopathie amyloïde.

Biopsie tissulaire

Une biopsie tissulaire implique le prélèvement d'un petit échantillon de tissu pour trouver des preuves de dépôts amyloïdes. Tout type de biopsie de tissu ou d'organe doit être envoyé à un laboratoire pour examen microscopique, où le tissu est coloré avec un colorant appelé « colorant au rouge du Congo ». Après l'avoir passée au microscope, la protéine amyloïde est découverte si elle prend une couleur vert pomme, ce qui entraîne un diagnostic d'amylose. Les domaines possibles pour des biopsies moins invasives comprennent :

  • Une biopsie du coussinet adipeux (sous la peau de l'abdomen)
  • Biopsie des glandes salivaires labiales (la lèvre interne) et,
  • Peau ou moelle osseuse.

Avec des combinaisons de ces tests sanguins et urinaires et de biopsies tissulaires, un diagnostic positif peut être confirmé chez un pourcentage élevé de patients.

Aspiration et biopsie de moelle osseuse

Il existe deux types de tests de moelle osseuse qui peuvent être effectués. Celles-ci impliquent le retrait d'une partie de la moelle osseuse liquide (un aspirat de moelle osseuse) et/ou le retrait d'un noyau de 1 à 2 cm de tissu de moelle osseuse en une seule pièce (une biopsie de moelle osseuse). Ces échantillons peuvent aider à déterminer le pourcentage de plasmocytes produisant de l'amyloïde, et lorsqu'ils sont testés en laboratoire, ils peuvent aider à identifier si les plasmocytes anormaux produisent des chaînes légères kappa ou lambda.

Biopsie d'organe

Si l'amylose est toujours suspectée mais que les biopsies de la moelle osseuse, du coussinet adipeux, des lèvres ou de la peau s'avèrent négatives, une biopsie chirurgicale de l'organe qui indique les symptômes doit être effectuée et envoyée à un laboratoire. Des échantillons de biopsie peuvent être prélevés sur :

Si un résultat de biopsie montre un diagnostic positif d'amylose, il est alors essentiel de déterminer également le type précis de protéine amyloïde impliquée. Dans ce cas, le type d'amylose AL doit être confirmé, montrant un trouble de la moelle osseuse avec atteinte des chaînes légères, également connu sous le nom de « dyscrasie des cellules plasmatiques ».


Matériaux et méthodes

Production d'IgG de lapin

Les gènes codant pour les immunoglobulines de lapin ont été synthétisés chimiquement (Genewiz, NJ, USA) suivi d'un sous-clonage dans pcDNA3.4 en utilisant un kit de clonage en fusion (Takara Bio, Shiga, Japon). Pour l'élimination des cystéines dans les chaînes kappa, une mutagenèse utilisant PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio) a été réalisée. Les IgG ont été produites en utilisant le système d'expression Expi293 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) par co-transfection de deux vecteurs codant respectivement pour les chaînes lourdes et légères. Les IgG ont été isolées par chromatographie d'affinité sur protéine A en utilisant rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, IL, USA) suivie de la purification finale par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) en utilisant HiLoad 16/600 Superdex 200 pg ou HiLoad 26/600 Superdex 200 colonne pg (GE Healthcare). La concentration en anticorps et en peptide antigénique a été déterminée par l'absorbance à 280 nm.

Mesure de la stabilité thermique

La stabilité thermique des anticorps a été déterminée par DSC à des concentrations de 12 à 30 M dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La collecte des données a été réalisée dans un instrument VP-Capillary DSC (Malvern Instruments, UK) à une vitesse de balayage de 1,0 ou 0,33°C min -1 entre 20 et 100°C. Les réanalyses ont été effectuées selon le protocole standard fourni par le fabricant.

Mesure de l'activité de liaison

Les paramètres thermodynamiques de l'interaction entre l'anticorps et l'antigène ont été examinés par calorimétrie de titrage isotherme (ITC) dans un instrument iTC200 (Malvern). Le peptide antigénique (Arg-Pro-His-Phe-Pro-Gln-Phe-pSer-Tyr-Ser-Ala-Ser : pSer représente la phosphosérine) a été synthétisé chimiquement (Scrum Inc, Tokyo, Japon). A la solution d'anticorps (A4, G11 : 2 M, A3 : 3 M) dans la cellule, 1,5 L de la solution de peptide antigénique (A4, G11 : 40 M, A3 : 60 M) a été titré par injection pendant 25 fois à l'intervalle de 160 s avec la vitesse d'agitation à 1000 rpm. Les mesures ont été effectuées dans du PBS à 25°C. Les mesures ont été effectuées trois fois dans la même procédure.

L'analyse des données

Les données DSC et ITC ont été analysées par Origin 8.0 (Originlab Corp., MA, USA). Pour les mesures DSC, l'analyse a été menée dans un modèle non à deux états avec deux processus de dénaturation. Pour les mesures de l'ITC, l'analyse a été réalisée en tant que modèle de liaison 1:1.


Discussion

Les anticorps dirigés contre les MTN et les RBD peuvent neutraliser avec une puissance élevée (moins de 0,01 μg/mL IC50). Alors que le RBD montre de nombreux sites de vulnérabilité aux anticorps qui ne se chevauchent pas (Barnes et al., 2020a Brouwer et al., 2020 Lv et al., 2020 Pinto et al., 2020 Yuan et al., 2020a), NTD semble contenir seulement un site unique de vulnérabilité à la neutralisation. Comme discuté ci-dessus, une des raisons à cela peut être la densité élevée de glycanes sur les MTN, avec 8 N-des glycanes liés dans les résidus �, une densité d'un glycane par � résidus, et peu de surfaces sans glycane qui peuvent être facilement reconnues par le système immunitaire. Une deuxième raison peut être l'angle d'approche restreint que nous avons observé pour tous les anticorps neutralisants dirigés contre les MTN connus, y compris les sept rapportés ici, qui s'approchent tous du pic de 𠇊 ci-dessus.” Nous notons dans ce contexte que l'analyse de la concurrence indique d'autres MTN -anticorps dirigés capables de reconnaître la pointe et de former un groupe de compétition distinct pour être non neutralisant (Liu etਊl., 2020a)— et l'autre grande surface sur NTD qui est exposée sur les faces de la pointe vers la membrane virale. Cette surface est principalement exempte de glycane, et les anticorps qui s'y attachent devraient s'approcher de 𠇌i-dessous.” Ainsi, contrairement à la RBD, où les anticorps neutralisants semblent avoir des angles d'approche différents, la présence d'un seul site de MTN la vulnérabilité peut être liée à l'exigence d'approcher d'en haut.

En plus de satisfaire aux exigences découlant de l'angle d'approche restreint, la prévalence relative plus élevée des anticorps dirigés contre les MTN-supersite est susceptible de provenir d'une immunogénicité accrue due à la fois à la densité relative plus faible des glycanes du supersite et à la nature flexible de l'épingle à cheveux N3 et Régions de reconnaissance primaires de la boucle N5, ainsi que leur capacité à assumer des conformations distinctes qui permettent la reconnaissance par divers anticorps. Dans le cas de la classe d'anticorps multi-donneurs VH1-24, qui provient du gène VH le plus répandu utilisé (Figure S1A), deux autres membres neutralisants dirigés contre les MTN ont récemment été identifiés : FC05 et CM25 (Voss etਊl ., 2020 Wang etਊl., 2021 ). Nous avons trouvé que VH1-24 était le gène VH humain le plus chargé négativement (Figure S5B). Un tel potentiel électrostatique négatif complète la nature hautement électropositive du supersite NTD que nous observons ici (Figureਆ D). Ainsi, de multiples facteurs, y compris la glycosylation et la flexibilité des épitopes, les restrictions sur l'angle d'approche et la complémentarité de la charge des paratopes, peuvent contribuer à la prévalence d'anticorps ciblant le supersite NTD.

Bien que l'approche du pic d'en haut observée pour tous les anticorps neutralisants dirigés contre les MTN soit cohérente avec un mécanisme de neutralisation basé sur l'encombrement stérique de l'interaction du pic avec le récepteur ACE2 au niveau de la membrane cellulaire, il n'y a actuellement aucune preuve de compétition entre les anticorps dirigés contre les MTN et ACE2 ( Liu etਊl., 2020a ). Un modèle alternatif plausible serait que la reconnaissance par les anticorps du supersite NTD entrave la fonction de pointe dans la médiation de la fusion du virus et des membranes des cellules hôtes. En effet, l'analyse de la résistance à la protéase du pic de MERS dans le complexe avec l'anticorps neutralisant MERS NTD 7d10 a montré que la liaison de 7d10 empêchait une sensibilité accrue à la protéase associée à la transition préfusion à postfusion (Zhou etਊl., 2019). Un mécanisme de stabilisation conformationnelle pourrait également expliquer comment un anticorps qui se lie à une seule sous-unité par trimère de pointe pourrait atteindre une neutralisation efficace. D'autres études seront nécessaires pour comprendre les mécanismes de neutralisation des anticorps qui reconnaissent le supersite NTD.

En ce qui concerne les implications vaccinales, nos résultats identifient clairement le site de vulnérabilité des MTN le plus susceptible de provoquer des anticorps neutralisants. Il existe de nombreuses façons d'incorporer ces informations dans la conception d'un vaccin, y compris l'inclusion de NTD avec le RBD dans les formulations de vaccins, l'affichage multivalent du supersite NTD sur les immunogènes à nanoparticules et la focalisation sur les épitopes via la création d'échafaudages affichant le N3 et #x003b2-hairpin et d'autres régions reconnues par les anticorps neutralisants dirigés contre les MTN.

En ce qui concerne le potentiel thérapeutique des anticorps dirigés contre les MTN, ceux-ci ciblent un site qui est éloigné de ceux ciblant les sites RBD et devraient donc fournir une neutralisation complémentaire aux anticorps dirigés RBD et nécessiter des voies d'échappement distinctes. Le fait que tous, ou une grande majorité, des anticorps neutralisant les MTN ciblent un seul site, suggère cependant qu'il peut être peu utile d'utiliser des combinaisons d'anticorps neutralisants dirigés contre les MTN.

Enfin, les nouvelles souches mutantes du SRAS-CoV-2, en particulier celles apparues au Royaume-Uni et en Afrique du Sud (souches B.1.1.7 et B.1.351, respectivement), sont préoccupantes en raison de la transmissibilité accrue, et ces souches échappent à la plupart des MTN dirigées anticorps neutralisants. B.1.1.7 inclut les mutations par délétion NTD D69-70 et D144, et la souche B.1.351 inclut les mutations NTD D242-244 et R246I. Conformément à nos résultats, les positions mutées, notamment 144, 242-244 et 246, se trouvent toutes dans le supersite NTD. Alors que la suppression à 69-70 est à l'extérieur du supersite, elle fait partie de la boucle N2 en épingle à cheveux de NTD, sa suppression pourrait avoir un impact significatif sur la conformation du supersite NTD. Notamment, seuls trois résidus étaient partagés entre les huit épitopes d'anticorps neutralisants dirigés contre les MTN analysés ici : Y144, R246 et L249 (tableau S5). Fait intéressant, deux de ces trois résidus sont les résidus exacts mutés dans les variantes émergentes préoccupantes (� et R246I), et L249 est probablement affecté par �-244. Ainsi, le revers d'un seul supersite est que la variation du supersite peut induire une résistance contre la plupart des anticorps ciblant le site et être sélectionné parmi les variantes émergentes.


Résultats

Analyse des gènes de la région variable de la chaîne légère chez Zebra Finch

En utilisant les séquences variables IGL humaines (kappa et lambda), poulet (lambda) et grenouille (sigma) comme requêtes, nous avons identifié 21 IGL gènes de la région variable situés dans un cluster dans le chromosome 15 du génome du diamant mandarin. La localisation génomique de ces gènes de région variable chez le diamant mandarin est indiquée dans le tableau supplémentaire S1 (Matériel supplémentaire en ligne). La comparaison des séquences avec les séquences fonctionnelles de l'homme, du poulet et de la grenouille a indiqué que parmi les 21 IGL gènes de région variable, une seule séquence est fonctionnelle car elle contient une séquence codante complète sans mutations de décalage du cadre de lecture et/ou codons d'arrêt internes, deux résidus Cys conservés dans les régions FR1 et FR3 et un RSS approprié (fig. 1). La structure génomique de la fonction unique IGL Le gène de la région variable chez le diamant mandarin est illustré dans la figure supplémentaire S1 (Matériel supplémentaire en ligne). Le reste IGVL les gènes n'avaient pas le bon leader et/ou RSS ou étaient tronqués dans leurs extrémités 5' ou 3' (fig. supplémentaire S2, Supplementary Material en ligne), comme le poulet IGVL pseudogènes ( Reynaud et al. 1987).Seules quatre séquences contenaient des codons d'arrêt internes (fig. S2 supplémentaire et données supplémentaires, matériel supplémentaire en ligne).

Alignement de séquences de variables IGL. Les séquences de référence choisies au hasard d'isotypes connus kappa (trois séquences IGVK de l'humain), lambda (trois séquences IGVL de l'humain et une IGVL du poulet) et sigma (l'IGVS de la grenouille) ont été extraites de Das et al. (2008). Les marqueurs moléculaires cladistiques qui distinguent les trois isotypes (κ, et ) sont mis en évidence. Les longueurs des séquences d'espacement RSS sont données. La numérotation des positions d'acides aminés dans le segment V est basée sur les séquences IGVK et IGVL humaines, et les lacunes relatives aux séquences IGVS de grenouille sont indiquées par "a" et "b" (Das et al. 2008).

Alignement de séquences de variables IGL. Les séquences de référence choisies au hasard des isotypes kappa (trois séquences IGVK de l'humain), lambda (trois séquences IGVL de l'humain et une IGVL du poulet) et sigma (l'IGVS de la grenouille) ont été tirées de Das et al. (2008). Les marqueurs moléculaires cladistiques qui distinguent les trois isotypes (κ, et ) sont mis en évidence. Les longueurs des séquences d'espacement RSS sont données. La numérotation des positions d'acides aminés dans le segment V est basée sur les séquences IGVK et IGVL humaines, et les lacunes relatives aux séquences IGVS de grenouille sont indiquées par "a" et "b" (Das et al. 2008).

Analyse de IGL Jointure et gènes de région constante dans Zebra Finch

A partir de la recherche de similarité utilisant comme requêtes, cinq séquences constantes IGL fonctionnelles (une IGCK et deux IGCL d'humain, une IGCL de poulet et une IGCS de grenouille), nous n'avons identifié qu'une seule IGL gène codant pour une constante dans le génome du diamant mandarin. Ce gène est situé à 4,5 kb en aval du gène de la région variable fonctionnelle unique. Les EST et les séquences d'ADNc confirment la présence d'un seul IGL gène à codage constant chez le diamant mandarin parce que les séquences d'EST et d'ADNc identifiées s'alignent - avec presque 100 % d'identité et sans lacunes - à une position génomique unique dans le génome du diamant mandarin qui correspond à la position de l'unique IGCL gène fonctionnel (tableau supplémentaire S2 et données supplémentaires, matériel supplémentaire en ligne). Pour identifier le IGL gène de la région de jonction dans le génome du diamant mandarin, nous avons recherché le RSS conservé dans la région de 4,5 kb entre les gènes de la variable fonctionnelle et de la région constante, car le gène de la région de jonction est trop court (généralement 12 acides aminés) pour être identifié par les recherches Blast . Une fois le RSS potentiel identifié dans cette région de 4,5 kb, nous avons traduit les séquences nucléotidiques à l'extrémité 3' du RSS en acides aminés et comparé la séquence traduite avec les séquences des régions de jonction IGL humaines, de poulet et de grenouille, qui ont été identifiées dans notre étude précédente ( Das et al. 2008). En utilisant cette méthode, nous avons identifié une seule fonction IGL gène de la région de jonction chez le diamant mandarin.

Identification de l'isotype IGL du diamant mandarin

Pour caractériser l'isotype des séquences IGL du diamant mandarin, nous avons utilisé les marqueurs moléculaires cladistiques, que nous avons précédemment décrits ( Das et al. 2008). Comme les séquences IGVL d'autres tétrapodes, la seule séquence de région variable fonctionnelle du diamant mandarin est dépourvue de Ser ou Thr en position 7 et ne possède pas de résidu aromatique volumineux (Phe ou Tyr) en position 53 ( fig. 1). Les séquences IGVL des tétrapodes ont généralement un motif DEAD (Asp–Glu–Ala–Asp) assez conservé dans la région FR3 ( Das et al. 2008). Cependant, comme la séquence IGVL de poulet (c'est-à-dire DEAV en position 64-67), le résidu Asp est substitué à Val en position 67 ( fig. 1).

Conformément à la séquence de région variable, les marqueurs moléculaires dans les séquences de jonction et de région constante chez le diamant mandarin les classent également en tant que séquences de chaîne légère lambda (fig. 2 et 3). De plus, comme les gènes de la chaîne légère lambda des mammifères, les séquences RSS flanquant le gène de la région variable fonctionnelle unique et le gène de la région de jonction sont interrompues par un espaceur de 23 pb et de 12 pb, respectivement, chez le diamant mandarin. IGL lieu. Par conséquent, les marqueurs moléculaires dans les séquences de régions variables, de jonction et constantes chez le diamant mandarin indiquent que, comme le poulet ( Sanders et Travis 1975) et le canard ( Magor et al. 1994), le génome du diamant mandarin code uniquement l'isotype lambda d'Ig.

Alignement des séquences des régions de jonction IGL. Les séquences de référence choisies au hasard d'isotypes connus kappa (trois séquences IGJK d'humain), lambda (trois séquences d'IGJL d'humain et une IGJL de poulet) et sigma (deux IGJS de grenouille) ont été extraites de Das et al. (2008). Les marqueurs moléculaires cladistiques qui distinguent les trois isotypes (κ, λ et σ) sont mis en évidence ( Das et al. 2008). Les longueurs des séquences d'espacement RSS sont affichées.

Alignement des séquences des régions de jonction IGL. Les séquences de référence choisies au hasard d'isotypes connus kappa (trois séquences IGJK d'humain), lambda (trois séquences d'IGJL d'humain et une IGJL de poulet) et sigma (deux IGJS de grenouille) ont été tirés de Das et al. (2008). Les marqueurs moléculaires cladistiques qui distinguent les trois isotypes (κ, λ et σ) sont mis en évidence ( Das et al. 2008). Les longueurs des séquences d'espacement RSS sont affichées.

Alignement de séquences constantes IGL. Les séquences de référence des isotypes connus kappa (une séquence IGCK humaine), lambda (deux IGCL humaine et une IGCL provenant de poulet) et sigma (une IGCS provenant de grenouille) ont été extraites de Das et al. (2008). La numérotation des positions d'acides aminés dans le segment C est basée sur Das et al. (2008). L'écart relatif à la séquence IGCS de la grenouille et les écarts relatifs à la séquence IGCL du diamant mandarin sont caractérisés par des alphabets. Les marqueurs moléculaires cladistiques qui distinguent les trois isotypes (κ, et ) sont mis en évidence.

Alignement de séquences constantes IGL. Les séquences de référence des isotypes connus kappa (une séquence IGCK humaine), lambda (deux IGCL humaine et une IGCL provenant de poulet) et sigma (une IGCS provenant de grenouille) ont été extraites de Das et al. (2008). La numérotation des positions d'acides aminés dans le segment C est basée sur Das et al. (2008). L'écart relatif à la séquence IGCS de la grenouille et les écarts relatifs à la séquence IGCL du diamant mandarin sont caractérisés par des alphabets. Les marqueurs moléculaires cladistiques qui distinguent les trois isotypes (κ, et ) sont mis en évidence.

De manière frappante, la séquence de région constante IGL du diamant mandarin peut être distinguée des séquences de région constante IGL tétrapodes car elle contient une insertion unique d'un tronçon de six acides aminés (QQQSST) ( fig. 3). Cette insertion est confirmée par le fait que toutes les séquences d'EST/ADNc, lorsqu'elles sont traduites, incluent les six acides aminés supplémentaires (voir le tableau supplémentaire S2 et les données supplémentaires, matériel supplémentaire en ligne). Pour analyser plus en détail cette insertion, nous avons généré un modèle 3D de la protéine IGCL du diamant mandarin et cartographié l'insertion sur le modèle 3D ( fig. 4). Notre analyse prédit que l'insertion QQQSST prolonge une boucle située dans la région entre l'IGVL et l'IGCL d'environ 9 ( fig. 4 supplémentaire fig. S4 , Supplementary Material en ligne). Bien que cette boucle étendue soit censée réduire la distance entre les chaînes légères et lourdes d'Ig de près de 6 Å ( fig. supplémentaire S4 , Matériel supplémentaire en ligne), elle ne semble pas affecter le contact entre les différentes chaînes d'Ig. Cette supposition mérite d'être testée expérimentalement.

L'insertion d'acides aminés de la séquence protéique IGCL du diamant mandarin est cartographiée sur un modèle 3D. Le modèle 3D théorique pour le diamant mandarin IGCL (montré en cyan clair) a été construit en utilisant comme modèle la structure résolue expérimentalement d'une chaîne lambda IGL humaine (montrée en vert code d'accession PDB : 1A8J). Les structures prédites et modèles ont été structurellement alignées pour mettre en évidence la région d'insertion (indiquée en rouge). Le panneau supérieur montre une représentation de bande dessinée et le bas montre une représentation de surface des deux structures.

L'insertion d'acides aminés de la séquence protéique IGCL du diamant mandarin est cartographiée sur un modèle 3D. Le modèle 3D théorique pour le diamant mandarin IGCL (montré en cyan clair) a été construit en utilisant comme modèle la structure résolue expérimentalement d'une chaîne lambda IGL humaine (montrée en vert code d'accession PDB : 1A8J). Les structures prédites et modèles ont été structurellement alignées pour mettre en évidence la région d'insertion (indiquée en rouge). Le panneau supérieur montre une représentation de bande dessinée et le bas montre une représentation de surface des deux structures.

Organisation génomique du locus IGL chez Zebra Finch

Dans le locus de codage kappa et sigma de la plupart des tétrapodes, plusieurs gènes de région de jonction sont présents dans un cluster, suivis d'un seul gène constant, tandis que dans le locus de codage lambda, les gènes de jonction et constants se produisent comme IGJL–IGCL blocs, qui ont généralement plusieurs copies. Seul le poulet en a un IGJL–IGCL bloc ( Das et al. 2008). Les IGL le locus chez le diamant mandarin contient une fonction IGVL gène, plusieurs pseudo-IGVL gènes, et un seul IGJLIGCL bloc ( fig. 5), comme le locus poulet ( Reynaud et al. 1985, 1987).

Diagrammes schématiques des organisations génomiques des loci de la chaîne légère lambda chez l'homme, le cheval, le poulet et le diamant mandarin (pas à l'échelle). Les bâtonnets au-dessus et au-dessous des lignes indiquent des gènes situés sur des brins opposés en fonction de la séquence particulière du génome. Les bâtonnets longs montrent des gènes fonctionnels et les bâtonnets courts indiquent des pseudogènes. Les informations de position des gènes de la chaîne lambda de l'homme, du cheval et du poulet sont tirées de Das et al. (2008).

Diagrammes schématiques des organisations génomiques des loci de la chaîne légère lambda chez l'homme, le cheval, le poulet et le diamant mandarin (pas à l'échelle). Les bâtonnets au-dessus et au-dessous des lignes indiquent des gènes situés sur des brins opposés en fonction de la séquence particulière du génome. Les bâtonnets longs montrent des gènes fonctionnels et les bâtonnets courts indiquent des pseudogènes. Les informations de position des gènes de la chaîne lambda de l'homme, du cheval et du poulet sont tirées de Das et al. (2008).

La comparaison du locus IGL entre le poulet et le diamant mandarin montre que chez ces espèces à la fois le nombre et la position des IGL les gènes sont très similaires ( fig. 5), malgré le fait que ces espèces ont divergé de plus de 100 Ma ( Brown et al. 2008). La principale différence entre les deux loci est la présence de quelques pseudogènes à orientation inverse chez le poulet. Contrairement à la conservation générale du locus IGL observée entre les deux espèces d'oiseaux, la comparaison des IGL locus entre différentes espèces de mammifères (c. Dans la région constante, l'homme et le cheval contiennent sept IGJLIGCL blocs, mais la distribution des gènes fonctionnels et des pseudogènes est différente entre les deux espèces ( fig. 5). Dans la région variable, le nombre et la distribution des gènes fonctionnels et des pseudogènes varient également entre les loci lambda humains (32 fonctionnels et 42 pseudogènes de région variable) et le cheval (25 fonctionnels de région variable et 20 pseudogènes).


Discussion

Nous avons entrepris de caractériser biophysiquement les six isotypes et sous-types humains des chaînes légères et des neuf chaînes lourdes en ce qui concerne la production recombinante et la cinétique de liaison à l'antigène. Nos tentatives d'expression bactérienne de ces isotypes n'ont pas abouti à des productions de protéines détectables, même lorsqu'elles sont appliquées pour l'ensemble des IgG1 comme indiqué précédemment 21 . Compte tenu de la nature humaine des anticorps nécessitant une modification post-traductionnelle (un facteur que nous voulions exclure), l'échec de l'expression bactérienne était sans conséquence. Les raisons de l'échec de l'expression bactérienne peuvent être attribuées aux différents plasmides bactériens utilisés, ainsi qu'aux différentes séquences variables.

À notre connaissance, notre étude est l'une des premières comparaisons complètes de tous les isotypes et sous-types connus des chaînes lourdes et légères humaines utilisant deux anticorps modèles contre le même antigène simultanément. Il convient de noter que la numérotation des familles Cλ ne s'exécute pas dans l'ordre car certaines familles Cλ (par exemple Cλ4 & Cλ5) se sont avérées plus tard être des pseudogènes ou des gènes théoriques 17 . En fait, pour étudier uniquement les effets de la CL, nous avons conservé la VL d'origine, formant des variantes hybrides Vκ-Cλ.

Sur les isotypes de la chaîne lourde, l'IgM devrait présenter une oligomérisation distincte en formes principalement pemtamères/hexamères avec quelques intermédiaires 10 même sans co-transfection de plasmides à chaîne J (Fig. 1). Une telle oligomérisation pour IgM est immunologiquement supérieure dans l'activation du système du complément que les formes monomériques 11, faisant des variantes d'IgM des candidats appropriés pour cibler les cellules cancéreuses métastatiques circulatoires qui seraient atténuées par l'immobilisation des antigènes via l'agglutination. Bien que l'IgG4 ait déjà été signalé comme présentant un échange d'armes Fab in vivo 16,26, un tel échange n'aurait pas d'effet dans nos méthodes d'expression monoclonale, maintenant la validité de nos caractérisations biophysiques.

La comparaison des taux d'association et de dissociation des variants CH à leurs homologues commerciaux (Figs 2 et 3) montre la faisabilité générale du changement d'isotype CH pour le Trastuzumab et le Pertuzumab, et éventuellement pour tous les anticorps thérapeutiques. Étant donné que les fonctions immunitaires des IgD sécrétées restent énigmatiques et les faibles profils de production de protéines des variants Trastuzumab et Pertuzumab IgD, il peut être nécessaire de reconsidérer l'utilisation des IgD sécrétées comme variant thérapeutique. Le fait que le récepteur IgD murin ne se lie pas à l'IgD 27 humaine alors que le récepteur IgD humain peut se lier à la fois à l'IgD et à l'IgA1 humaines avec la modification similaire des O-glycanes dans la région charnière 28, rend IgD difficile à étudier en utilisant des modèles animaux. Pour éliminer le facteur de confusion de la glycosylation, nous avons produit tous nos variants CH dans des lignées cellulaires HEK humaines sur des cellules CHO ou COS animales.

Il est intéressant de noter que les effets d'avidité du Pertuzumab IgM ont inversé la tendance générale à une liaison plus faible par rapport au Trastuzumab. Bien que cela ne se soit produit que pour le modèle Pertuzumab et que nous soyons donc prudents de généraliser cela à tous les anticorps, de telles observations plaident en faveur de l'utilisation de l'IgM comme variante CH potentielle lorsque l'on travaille avec des candidats anticorps à liaison plus faible. Bien que l'IgG ait été le choix prédominant pour les anticorps thérapeutiques, l'IgM peut encore être plus approprié que l'IgG lorsqu'il peut augmenter la force de liaison globale et ses effets d'agglutination supérieurs lorsqu'il s'agit d'antigènes circulants. Cependant, l'utilisation d'IgM en tant que médicament thérapeutique comportait un revers historique 29 et l'absence d'un modèle animal approprié présentait en outre comme des obstacles majeurs. Bien qu'il existe de multiples récepteurs pour les IgM tels que Fcα/μR et FcμR, et que le Fcα/μR humain se lie à la fois aux IgM et IgA humains et murins, il est exprimé sur différents types de cellules par rapport aux souris. Chez l'homme, seules les cellules B du centre pré-germinal (cellules IgD + /CD38 +) expriment les récepteurs, tandis que les homologues murins ne sont exprimés que sur la population de cellules B circulante et résidente 30 . La réactivité croisée du Fcy/μR murin avec les IgM et IgA humaines n'est pas encore établie, ce qui rend ce récepteur impropre aux études de modèles animaux. Néanmoins, un récepteur récemment découvert - FcμR(TOSO/FAIM3) 31,32 - présent à la fois sur l'homme et la souris, a démontré une réactivité IgM inter-espèces. Il existe cependant également des différences dans la localisation des récepteurs. Il est exprimé à la fois dans la rate et le thymus humains et murins, mais aussi sur les leucocytes du sang périphérique pour l'homme, et la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques pour la souris 31,32. Compte tenu de ces différences, il est donc peu probable que le modèle murin convienne aux IgM. enquêtes, en particulier pour les expériences de localisation.

Nos autres variantes CH, IgA1, IgA2 et IgE ont montré des constantes d'équilibre de dissociation, des lectures de taux d'association et de dissociation similaires au sous-type IgG1 lorsqu'elles sont préchargées dans des capteurs de protéine L, ce qui en fait de bons candidats possibles pour les cancers des muqueuses et l'allergooncologie (IgE). Il y a des indices d'effets d'avidité lorsque nous avons comparé les résultats à l'antigène préchargé (Her2), les variants isotypiques Trastuzumab ont affiché plus d'effets d'avidité où les variants IgM et IgD avaient plus de fluctuations dans la constante d'association, mais pas pour les variants isotypiques Pertuzumab. De même, la variabilité des taux de dissociation entre les variantes CH, étant plus prononcée sur les deux modèles d'anticorps, présentait des différences où pour Trastuzumab, IgE, IgA2 et IgD ont montré une différence de 1 log lorsqu'ils sont liés à Her2 préchargé, tandis que pour Pertuzumab, les différences dans le Kd étaient plus prononcés pour les IgM, IgA1 et IgA2.

À part le réduire aux effets liés à l'isotype-CDR, nous n'avons pas pu déterminer la cause de ces différences d'avidité. Néanmoins, le pré-chargement des variants d'anticorps sur la protéine L a montré que les régions V de ces variants isotypiques étaient fonctionnelles afin d'être reconnues par la protéine L et se lient également à Her2.

Étant donné que de nombreux cancers Her2 + surviennent dans les zones canalaires et que nos résultats n'excluent pas la pertinence des variants isotypiques IgE et IgA, la disponibilité de ces variants Trastuzumab/Pertuzumab IgE et IgA peut être idéale pour de telles localités. Ces variantes peuvent être utilisées en association avec une dose réduite de variantes IgM/IgG sanguines pour contrôler les métastases cancéreuses circulantes et, ce faisant, réduire les effets secondaires cardiaques associés à des doses élevées de Trastuzumab IgG1 seul. Cependant, l'absence d'un récepteur d'Ig de souris répondant aux IgA 12 et IgE 15 humaines est peut-être la principale raison pour laquelle les anticorps thérapeutiques de ces isotypes ne sont pas encore courants et pourraient ne pas être approuvés pour des essais cliniques dans un proche avenir.

Bien que les résultats des variantes d'IgG soient similaires, divers sous-types d'IgG humaines (IgG2 et IgG4) ont présenté des propriétés de protection différentes chez la souris contre Crytococcus neoformans 22 (levure encapsulée). Étant donné que tous les sous-types d'IgG humaines peuvent traverser le placenta 33 , les thérapies de cet isotype ne sont probablement pas adaptées à une utilisation pendant la grossesse, ce qui plaide en faveur de l'utilisation d'autres isotypes pour réduire les possibilités d'affecter l'enfant à naître et donc le refus de thérapies ciblées pendant la grossesse.

Comme preuve de concept dans différentes localisations, nos expériences préliminaires (non montrées) sur des souris nudes ont montré que les IgG restaient plus longtemps dans la circulation systémique par rapport aux autres isotypes, qui étaient éliminés dans les reins et le foie dans les premiers jours. Cependant, ce résultat n'est pas concluant car les expériences de localisation chez la souris sont très limitées étant donné que les récepteurs d'Ig de souris pour les autres isotypes n'interagissent pas avec les variantes d'Ig humaines.

Néanmoins, la comparaison des différentes variantes CH a montré une tendance générale à de meilleures mesures de liaison lors de l'utilisation des biocapteurs AHC de capture d'IgG Fc (Fig. 5) par rapport aux biocapteurs de protéine L (Fig. 3). Étant donné que nos précédents travaux sur les chaînes légères du Trastuzumab 19 ont montré que les structures VL peuvent affecter la liaison à la protéine L, nous avons cherché à exclure les interférences provoquées par la protéine L sur le site de liaison Her2 en utilisant AHC au lieu de la protéine L en nous concentrant sur l'analyse des chaînes légères (Fig. 3).

Il reste énigmatique pourquoi le système Ig humain a 5 familles de Cλ mais un seul Cκ. Bien que des études aient montré que les chaînes légères flottantes libres sont associées à des réponses inflammatoires et à l'auto-immunité 34 , le rôle de la chaîne légère a été assez insaisissable en l'absence de récepteurs Igκ et Igλ spécifiques connus. On a constaté que les chaînes légères affectent la in vivo demi-vie des anticorps (où huIgG2λ avait une demi-vie plus courte que huIgG2κ chez la souris) 35 , ainsi qu'un rôle dans la dissociation des antigènes 19 . Pour cette raison, il se peut que les effets de CL sur la demi-vie des anticorps et la liaison à l'antigène ne dépendent pas uniquement de CL-CH, mais doivent inclure les autres régions sous forme de chaînes lourdes et légères entières. Cela démontre la nécessité d'une analyse détaillée de la façon dont les régions variables et constantes des anticorps des deux chaînes se réunissent pour affecter la liaison à l'antigène, la production et également les demi-vies.

Nos résultats CL sont cohérents avec Montaño et al. 35 (où le CL n'a pas provoqué d'effets significatifs), mais différait de Ponomarenko et al. (dont l'équipe a découvert que les variants CL présentaient différentes liaisons aux épitopes peptidiques cycliques et linéaires). Puisque notre antigène est la partie extracellulaire recombinante de Her2, et Ponomarenko et al. des différences observées sur la base de la conformation de l'antigène, il est possible que les effets de variation de CL soient dépendants de l'interaction anticorps-antigène 18 et ne puissent pas être généralisés à tous les anticorps. Il est probable que la structure et la rigidité de l'anticorps, influencées par la modification de la chaîne légère comme suggéré par Toughiri et al. 20 , peut sous-tendre le mécanisme des différences. Néanmoins, il est clair que pour la liaison Her2 extracellulaire recombinante, les variants Trastuzumab et Pertuzumab CL n'ont pas montré d'effets significatifs dans nos tests.

Actuellement, il reste des obstacles importants pour que les variantes CH et CL des anticorps thérapeutiques soient adoptées dans une utilisation clinique réelle étant donné que les expérimentations animales précliniques dans ce domaine sont très limitées. Sans méthodes appropriées pour évaluer à la fois les avantages potentiels et l'immunopathologie des isotypes/sous-types d'anticorps en tant que thérapie (par exemple, anaphylaxie IgE, néphropathie IgA, facteur rhumatoïde IgM, syndrome Hyper-IgD), il faudra peut-être des décennies avant que l'échange d'isotypes CH ne soit adopté comme la prochaine génération d'anticorps thérapeutiques.


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Anticorps secondaire de chèvre anti-IgG humaine (H+L), HRPThermo Fisher ScientificN° de cat. 31410 RRID : AB_228269
Anticorps IgG Fab de souris anti-humain (HRP)GenScriptChat#A01855-200
Souris anti-humain CD20-PECy7BD PharMingenN° de cat. 560735 RRID : AB_399985
APC Souris anti-humain CD19BD PharMingenChat#555415
Anti-CD27-PEBD BiosciencesCat#555441 RRID : AB_395834
Anti-hCD32BD PharMingenChat #557333
Anti-HBs H004Wang etਊl., 2020bN / A
CR3022ter Meulen etਊl., 2006N / A
Anticorps polyclonal anti-NGu etਊl., 2020N / A
Souches bactériennes et virales
E.਌oli Cellules chimiquement compétentes Trans5αTransGen BiotechChat#CD201-01
Virus SARS-CoV-2 authentique, nCoV-SH01 (GenBank : <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"MT121215.1","term_id":"1819735426","term_text ":"MT121215.1">> MT121215.1)Wu etਊl., 2020bN / A
Produits chimiques, peptides et protéines recombinantes
Streptavidine HRPBD BiosciencesChat#554066
Streptavidine APCBD BiosciencesCat#554067 RRID : AB_10050396
Streptavidine PEeBioscienceChat#12-4317-87
Bloc BD Fc humainBD PharMingenChat #564220
Protéine SARS-CoV-2 S (RBD)GenScriptChat#Z03479
Protéine SARS-CoV-2 S1GenScriptChat#Z03501
Protéine recombinante 2019-nCoV S2 (C-Fc)NovoprotéineChat#DRA48
Protéine Spike SARS-CoV-2 (DPE, balise His &)GenScriptChat#Z03481
Insecte-C-Son NPGenScriptChat#Z03480
Recombinant 2019 nCoV Spike S (acide aminé 14-1212)Biosystèmes KactusChat#COV-VM5SS
Recombinant 2019 nCoV Spike RBDBiosystèmes KactusChat#COV-VM4BD
Inhibiteur de la RNAsine Plus RNasePromegaChat#N2615
4 × dNTPS (100 mM)Solarbio Sciences de la VieChat#PC2300
Eau sans DNase/RNaseSolarbio Sciences de la VieChat#R1600
PBS (10 × ), pH 7,2-7,4Solarbio Sciences de la VieChat#P1022
1 M Tris-HCl, pH 9,0Solarbio Sciences de la VieChat#T1160
IGEPAL CA-630SigmaChat#I8896
DiméthylsulfoxydeSigmaChat #2650
Albumine de sérum bovinWeiAo Biotech, ShanghaiChat#WH3044
Sérum Fœtal BovinGÉMEAUXChat#900-108
Saccharose ultra-purMacklin biochimiqueChat#S824459
Sel de sodium rouge crésolMacklin biochimiqueChat#C806031
ABTS Chromogène / solution de substrat pour ELISAThermo Fisher ScientificChat#00-2024
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0InvitrogèneChat#15575-038
Mélange de sel équilibré Hank&# x02019s (D-Hanks)Solarbio Sciences de la VieChat#H1045-500
EZ TransLife iLAB Bio Technology, ShanghaiChat#AC04L082
Réactif TRIzol LSThermo Fisher ScientificN° de chat 10296010
Essais commerciaux critiques
Colonnes magnétiques LSMiltenyi BiotechChat #130-042-401
Microbilles CD19, humainMiltenyi BiotechChat #130-097-055
Biotine EZ-Link Sulfo-NHS-LC, sans format de poidsThermo Fisher ScientificChat#39257
Kit BirA Biotine-Protéine LigaseAviditéChat#BIRA500
Colonnes de dessalage Zeba Spin, 7K MWCOThermo Fisher ScientificChat#89889
Transcriptase inverse en exposant IIIThermo Fisher ScientificChat #18080044
ADN polymérase HotStarTaqQIAGENChat#203209
Protéine G Sépharose 4 Débit RapideGE SantéChat#17061805
Tampon d'élution IgG Pierce™Thermo Fisher ScientificChat #21004
Histopaque-10771SigmaChat#10771
ÂgeI-HFBioLabs de la Nouvelle-AngleterreChat#R3552L
BsiwI-HFBioLabs de la Nouvelle-AngleterreChat#R3553L
XhoIBioLabs de la Nouvelle-AngleterreChat#R0146L
SalI-HFBioLabs de la Nouvelle-AngleterreChat#R3138S
ADN polymérase T4BioLabs de la Nouvelle-AngleterreChat#M0203L
Kit RT-PCR PrimeScript en une étapeTakaraChat#RR064B
Système de dosage de la luciférasePromegaChat#E1501
Modèles expérimentaux : lignées cellulaires
Lignée cellulaire HEK293F( Wu etਊl., 2020b N / A
Lignée cellulaire HEK293T( Xia etਊl., 2020a N / A
Système d'expression Expi293Thermo Fisher ScientificChat#A14635
Lignée cellulaire Huh-7( Xia etਊl., 2020a N / A
Lignée cellulaire Vero-E6( Xia etਊl., 2020a N / A
Lignée cellulaire Raji( Jaume etਊl., 2011 N / A
Oligonucléotides
Amorces aléatoiresThermo Fisher ScientificChat#48190011
ADN recombinant
vecteur d'expression IG㬱von Boehmer etਊl., 2016N / A
Vecteur d'expression IGκvon Boehmer etਊl., 2016N / A
Vecteur d'expression IGλvon Boehmer etਊl., 2016N / A
pNL4-3.luc.REXia etਊl., 2020aN / A
pcDNA3.1-SRAS-CoV-1-SXia etਊl., 2020aN / A
pcDNA3.1-SRAS-COV-2-SXia etਊl., 2020aN / A
Vecteur d'expression IG㬱-GRLRRobbiani etਊl., 2019N / A
Logiciels et algorithmes
PRISMEGraphPadhttps://www.graphpad.com
IgBlastYe etਊl., 2013https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/
IMGT/V-QUESTBrochet etਊl., 2008http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest
Autres
Système de filtration sous vide jetable stérile 50 mlMillipore SigmaChat#SCGP00525
Filtres centrifuges Amicon Ultra-4 Ultracel-30KMerck Millipore Ltd.Chat#UFC803096
Unités de filtration centrifuge Ultrafree-MC, 0,22uM GV DURAPOREMerck Millipore Ltd.Chat#UFC30GV0S
Pipette multiple Pipet-Lite L12-20XLS+PLUIEChat#17013808
Tubes cryogéniques généraux de stockage à long termeNalgèneChat#5000-1020
Thermocycleur SimpliAmpThermo Fisher ScientificCat# <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"A24812","term_id":"80001","term_text":"pir||A24812">> A24812
Filtre à vide pour bouteille de 500  mL, pores de 0,20 μmThermo Fisher ScientificChat#566-0020
Tubes ACCUSPIN stériles, capacité 50 mlSigmaChat#A2055-10EA

La disponibilité des ressources

Contact principal

De plus amples informations et les demandes de ressources et de réactifs doivent être adressées et seront traitées par le contact principal, Qiao Wang ([email protected]).

Disponibilité des matériaux

Tous les réactifs uniques générés dans cette étude sont disponibles auprès du contact principal avec un accord de transfert de matériel dûment rempli. Le partage d'anticorps avec des chercheurs universitaires peut nécessiter un paiement pour couvrir le coût de génération et un accord de transfert de matériel rempli.

Disponibilité des données et des codes

L'article publié comprend tous les ensembles de données générés ou analysés au cours de cette étude. Les données originales ont été déposées Données Mendeley : https://data.mendeley.com/datasets/bjpky4bzsd/1.

Modèle expérimental et détails du sujet

Sujets humains

Le recrutement de bénévoles et les prélèvements sanguins ont été effectués à l'hôpital de Zhoushan selon un protocole approuvé par le comité d'éthique de la recherche de l'hôpital de Zhoushan (2020-003). Des expériences liées à tous les échantillons humains ont été réalisées à l'École des sciences médicales de base de l'Université de Fudan selon un protocole approuvé par le comité d'éthique de l'établissement (2020-C007). Participants à l'étude, 16 donneurs convalescents, dont les infections ont été confirmées par PCR, et 8 donneurs naïfs non exposés. Tous les donneurs étaient âgés de 7 à 67 ans, avec une moyenne de 37 ans, et le ratio femme:homme était de 14:10 (Figure S1B).

Lignées cellulaires

Des cellules de rein embryonnaire humain 293T (HEK293T), des cellules d'hépatome humain Huh-7 et des cellules Vero-E6 de rein de singe vert d'Afrique (Xia etਊl., 2020a) ont été maintenues dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de chaleur -sérum bovin foetal inactivé (FBS), 100 U/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine. Des cellules Raji (lymphoblaste B du lymphome de Burkitt humain) (Jaume etਊl., 2011), ont été maintenues dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de FBS, 100 U/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine. Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées à 37ଌ dans 5% de CO2. Des cellules en suspension de rein embryonnaire humain 293F (HEK293F) ont été cultivées en utilisant le milieu OPM-293-CD05 sans sérum HEK293 (OPM Biosciences) à 37ଌ dans 5% de CO2 en secouant à 100 rpm.

Virus

L'authentique virus SARS-CoV-2, nCoV-SH01 (GenBank : <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"MT121215.1","term_id":"1819735426"," term_text":"MT121215.1">> MT121215.1) utilisé dans cette étude a été isolé de patients infectés au laboratoire de niveau de biosécurité 3 (BSL-3) du Shanghai Medical College, Fudan University (Wu etਊl., 2020b ). Le virus SARS-CoV-2 s'est propagé dans des cellules Vero-E6. Le stock de virus concentré a été aliquoté et stocké dans de l'azote liquide. Une aliquote du virus SARS-CoV-2 authentique transmis par lignée cellulaire, initialement lancée à partir du sérum du patient et stockée à �ଌ, a été décongelée pendant in vitro expériences d'infection cellulaire.

Bactéries

E.਌oli Les Trans5α (TransGen Biotech) ont été cultivés à 37ଌ avec agitation à 230 rpm.

Détails de la méthode

Collecte d'échantillons humains

Des échantillons de sang périphérique ont été prélevés sur des patients atteints du SRAS-CoV-2 à l'hôpital de Zhoushan dans la province du Zhejiang. Les échantillons de sérum ont été inactivés à la chaleur pendant 60 minutes à 56 °C, séparés par centrifugation de sang total coagulé et aliquotés pour être conservés à °x0221280 °x000b0C. Après un prélèvement de sang de 400 ml sur le donneur n°16, les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) ont été isolées à l'aide d'un tube de séparation cellulaire avec barrière frittée. Les PBMC isolées ont été remises en suspension dans 90 % de FBS inactivé par la chaleur additionné de 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) et cryoconservées dans de l'azote liquide.

Anticorps

Tous les anticorps monoclonaux humains clonés, leur version GRLR et l'anticorps monoclonal CR3022 précédemment rapporté (ter Meulen etਊl., 2006) ont été préparés par transfection transitoire de cellules de mammifère HEK293F comme précédemment rapporté (Wu etਊl., 2020b).

ELISA

La liaison ELISA d'échantillons de sérum ou de fractions d'anticorps IgG purifiés à partir d'échantillons de sérum ou d'anticorps IgG recombinants contre les protéines du SRAS-CoV-2, y compris les protéines S-ECD-, RBD-, S1-, S2- et N (voir les détails dans Key table des ressources) a été mesurée comme indiqué précédemment ( Wang etਊl., 2020b ). En bref, les plaques ELISA ont d'abord été recouvertes de 10 000a0 003bcg/ml d'antigène dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant une nuit à 4 000b0C, puis bloquées avec 2 % d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS. Le sérum ou le 1 er anticorps a été dilué en série 1:3 dans du PBS (concentration maximale, 1:10 pour le sérum, 10 μg/ml pour les monoclonaux) pour huit dilutions au total, et ajouté pour incubation pendant une heure à température ambiante . La visualisation a été effectuée avec une IgG anti-humaine de chèvre conjuguée à HRP (Thermo Fisher Scientific) ou une IgG Fab anti-humaine de souris conjuguée à HRP (GenScript). L'aire sous la courbe (AUC) a été calculée pour chaque anticorps par analyse en utilisant le logiciel PRISM pour évaluer la capacité de liaison à l'antigène. Les dosages ELISA utilisant des mutants RBD ont été effectués comme décrit ci-dessus, à l'exception de l'enrobage de RBD-Fc à une concentration de 2 & x000a0 & x003bcg/ml, et en utilisant le RBD de type sauvage comme référence pour la normalisation.

Concours ELISA

Les ELISA de compétition ont été effectués comme décrit précédemment (Wang etਊl., 2020b). Brièvement, les plaques ont été recouvertes de 2 μg/ml SARS-CoV-2 RBD ou 2 μg/ml SARS-CoV-2 S-ECD et incubées avec 15 μg/ml 1 er anticorps bloquant/ protéines (60 μg/ml pour l'anticorps CR3022) pendant deux heures. Les 2 èmes anticorps/protéines biotinylés (0,25 μg/ml) (15 μg/ml pour l'anticorps CR3022) ont été directement ajoutés pendant 30 minutes à température ambiante. La détection a été réalisée avec de la streptavidine-HRP (BD Biosciences). Le tampon PBS substitué au 1 er anticorps bloquant a été utilisé comme référence pour la normalisation, tandis que l'anticorps anti-HBs H004 ( Wang etਊl., 2020b ), qui n'a pas pu bloquer la liaison du 2 ème anticorps, a servi de négatif contrôler.

Préparation des virus pseudotypés SARS-CoV-2 et SARS-CoV-1

Les virus pseudotypés ont été produits comme indiqué précédemment ( Xia etਊl., 2020a ). En bref, les plasmides pNL4-3.luc.RE (le squelette du VIH-1 exprimant la luciférase) et pcDNA3.1-SARS-CoV-1-S/pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S (codant pour le S -des protéines de SARS-CoV-1 ou SARS-CoV-2) ont été co-transfectées dans des cellules HEK293T à l'aide du réactif de transfection VigoFect (Vigorous Biotechnology, Pékin). Le surnageant contenant les particules pseudotypées libérées a été récolté 72 heures après la transfection. Après centrifugation, le surnageant a été collecté, aliquoté et congelé à �ଌ. La production des mutants du pseudovirus SARS-CoV-2 a été réalisée comme décrit ci-dessus, sauf en utilisant les plasmides de pcDNA3.1-SARS-CoV-2 avec les mutations correspondantes (V341I, F342L, V367F, R408I, A435S, G476S et V483A) dans la protéine S ( Ou etਊl., 2020 ). Ces plasmides ont été construits en utilisant le plasmide de pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S comme matrice par un kit de mutation dirigée (Yeasen Biotech, Shanghai).

In vitro test de neutralisation par les virus pseudotypés SARS-CoV-1 et 𢄢

In vitro L'infection par le pseudovirus SARS-CoV-1 et SARS-CoV-2 a été réalisée comme décrit précédemment (Xia etਊl., 2020a). Brièvement, 1 10 4 cellules/puits Huh-7 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits dans du DMEM supplémenté avec 10 % de FBS. Les cellules ensemencées ont été cultivées pendant huit heures supplémentaires avant l'infection. Pour quantifier la capacité de neutralisation, le sérum humain (concentration maximale, 1:20), les anticorps polyclonaux purifiés à partir de sérum humain (concentration maximale, 50 μg/ml), ou les anticorps monoclonaux (concentration maximale, 10 ou 1 ou 0,625& #x000a0μg/ml) a été dilué en série à 1:2 dans du milieu DMEM pour neuf dilutions au total. Par la suite, les anticorps dilués ou les échantillons de sérum ont été incubés avec des pseudovirus SARS-CoV-1 ou 𢄢 pendant 30 minutes à 37 000b0C avant d'être ajoutés aux cellules Huh-7 pour infection. Pour les expériences de blocage de la neutralisation, différents antigènes (protéines RBD, S1, S2 ou S-ECD) ont été incubés à différentes concentrations, respectivement, avec 5 μg/ml d'IgG purifié du donneur #16 pendant une heure à 37ଌ avant incubation avec le pseudovirus SARS-CoV-2. Après incubation pendant une demi-heure, le mélange a finalement été ajouté aux cellules Huh-7 pour infection. Après 12 heures d'incubation, le surnageant a été remplacé par du milieu DMEM frais additionné de 2% de FBS. Le surnageant cellulaire a été retiré après culture pendant 48 heures supplémentaires, et les cellules ont été lysées pour la mesure de l'activité de la luciférase à l'aide d'un kit de test de luciférase Firefly (Promega) et d'un luminomètre conformément aux instructions du fabricant.

Les valeurs absolues de luciférase ont été mesurées et les valeurs relatives ont été calculées en normalisant le puits de contrôle de virus uniquement dans la même piste. Par exemple, la valeur absolue de la luciférase dans un puits de contrôle de pseudovirus uniquement (considéré comme référence) était de 5 × 10 4 , tandis que l'ajout d'un échantillon de sérum neutralisant pourrait le réduire à 1 × 10 4 . Par conséquent, les valeurs de luciférase normalisées ont été calculées comme 100 % dans le contrôle pseudovirus uniquement et 20 % pour ce sérum neutralisant. Étant donné que de nombreux aspects, tels que la concentration de pseudovirus, la concentration de cellules cultivées, l'état des cellules, la lecture d'immunofluorescence, etc., variaient considérablement entre différentes plaques et différents tests, la normalisation est nécessaire pour combiner les données à des fins de comparaison. Pour les tests de neutralisation sérique (figures 1 F et 1G), l'inverse de la dilution sérique qui a entraîné une inhibition de 50 % par rapport au pseudovirus seul a été rapporté comme le titre de neutralisation à 50 % (NT50).

In vitro test de neutralisation par le virus SARS-CoV-2 authentique

In vitro un test de neutralisation authentique du SRAS-CoV-2 a été effectué à l'aide de Vero-E6, comme indiqué précédemment ( Chi et&# x000a0al., 2020 ). Brièvement, 1 휐 4 cellules Vero-E6/puits ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits. Après culture pendant 24 heures, les anticorps dilués en série 1:4 (concentration maximale, 5 μg/ml) ont été mélangés avec 0,1 MOI (multiplicité d'infection) du virus SARS-CoV-2 authentique et incubés à 37ଌ pendant 30& #x000a0minutes. Ce mélange a ensuite été ajouté dans les cellules Vero-E6 cultivées. Les surnageants ont été collectés après une nouvelle culture pendant deux jours pour une PCR quantitative de transcription inverse et les cellules ont été analysées par immunofluorescence.

Pour l'immunofluorescence, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 20 minutes, lavées avec du PBS et perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS à température ambiante. Après blocage avec 3% de BSA, les cellules ont été incubées avec un anticorps polyclonal anti-N (Gu etਊl., 2020) à une dilution de 1:1000 pendant une nuit à 4ଌ et visualisées avec des IgG anti-souris d'âne Alexa Fluor 488 ( Thermo Fisher Scientific). Les noyaux ont été colorés au DAPI. Les cellules ont été imagées à l'aide d'une microscopie à fluorescence inversée Eclipse Ti-S (Nikon).

Pour la PCR quantitative de transcription inverse, l'ARN viral a été extrait du surnageant collecté à l'aide de Trizol LS (Thermo Fisher Scientific) et utilisé comme modèles pour l'analyse PCR quantitative par le kit RT-PCR One-Step PrimeScrip (Takara) en suivant les instructions du fabricant. Les amorces et la sonde utilisées ont été répertoriées dans le tableau S2. L'amplicon PCR par les amorces SARS-CoV-2-N-F et SARS-CoV-2-N-R a été inséré dans le plasmide pUC57 pour la génération de courbe standard. Le programme de la PCR quantitative de transcription inverse a été réalisé à l'aide du système de PCR en temps réel Mastercycler ep realplex (Eppendorf) comme suit : 95ଌ 5 minutes 40 cycles de 95ଌ 10 s, 50ଌ 30 s, 72ଌ 30 s.

In vitro test pour détecter l'entrée virale dépendante des anticorps

In vitro Les tests ADE du pseudovirus SARS-CoV-2 ont été effectués à l'aide de cellules Raji, comme indiqué précédemment (Jaume etਊl., 2011). Brièvement, 3 × 104 cellules Raji ont été ensemencées dans chaque puits de plaques à 96 puits recouvertes de 0,01 % de poly-L-lysine dans du PBS et cultivées pendant 24 heures. Les anticorps ont été dilués en série à 1:2 (concentration maximale, 100 μg/ml) dans du RPMI 1640 pour neuf dilutions au total, et ont été incubés avec le pseudovirus SARS-CoV-2 pendant 30 minutes. Le mélange a été appliqué sur les cellules Raji et cultivé pendant 60 heures. La mesure de l'activité luciférase a été effectuée comme décrit ci-dessus en utilisant un kit d'analyse de luciférase Firefly (Promega). Les valeurs absolues d'activité luciférase de tous les puits ont été normalisées à la valeur d'activité luciférase obtenue avec 2 & x000a0 & x003bcg/ml d'anticorps XG043 et exprimées comme le changement de pli de l'activité luciférase. Deux réplicats de XG043 (2 μg/ml) ont été réalisés sur chaque plaque et la valeur moyenne de l'activité luciférase de ces deux réplicats a été considérée comme référence (100 % d'activité luciférase relative, les lignes pointillées sur les figures 6 A, 6D et 6E Figure S6B). Étant donné que de nombreux facteurs (concentration virale, concentration cellulaire, lecture d'immunofluorescence, etc.) varient entre différentes plaques ou différents cycles d'expériences, une normalisation est nécessaire pour comparer les valeurs d'activité luciférase de différentes plaques. La raison du choix du XG043 comme référence est simplement parce que le XG043 a été le premier identifié pour induire un EIM dans nos études.

Pour que l'expérience bloque l'entrée virale dépendante des anticorps, différentes concentrations d'anti-hCD32 (BD PharMingen) ont été incubées avec les cellules Raji pendant 30 minutes à 37 ° C. Ensuite, le mélange d'anticorps 2 μg/ml XG005 et de pseudovirus SARS-CoV-2 a été ajouté aux cellules Raji traitées. Les plaques ont été incubées à 37°C pendant 60 heures avant la mesure des activités luciférase comme décrit ci-dessus.

Pour in vitro Tests ADE dépendant des cellules Raji utilisant un virus SARS-CoV-2 authentique, des cellules Raji cultivées ont été incubées avec le mélange de virus SARS-CoV-2 authentique et d'anticorps monoclonaux (concentration finale 4 μg/ml), XG038, XG016 et XG005, respectivement. Après 6, 24 ou 48 heures d'incubation, les cellules Raji ont été collectées pour une extraction d'ARN et une analyse PCR quantitative par transcription inverse. Les nombres de copies d'ARN de protéine N du SRAS-CoV-2 ont été calculés à l'aide d'une courbe standard composée de sept échantillons d'ADN de protéine N préparés avec des dilutions en série de 10 fois.

Production de protéines

L'ADNc de type sauvage optimisé en codons du domaine de liaison au récepteur (RBD) du SRAS-CoV-2 (acide aminé 330�) avec une balise Avi (GLNDIFEAQKIEWHE) a été synthétisé (GENEWIZ) et cloné dans le vecteur pACgp67 avec un C- terminal 8 × Son étiquette pour la purification. Le SARS-CoV-2 RBD a été exprimé en utilisant le système baculovirus Bac-to-Bac. L'ADN de bacmide extrait a ensuite été transfecté dans des cellules Sf9 en utilisant le réactif Cellfectin II (Invitrogen). Les virus à faible titre ont été récoltés puis amplifiés pour générer un stock de virus à titre élevé. Le surnageant contenant le RBD sécrété sans glycosylation a été récolté 72 heures après l'infection et la protéine RBD a été capturée par résine Ni-NTA (GE Healthcare) et purifiée. L'analyse SDS-PAGE a révélé une pureté de plus de 95 % de la protéine recombinante purifiée.

Pour la mutagenèse dirigée et l'expression des mutants RBD, le fragment SARS-CoV-2 RBD (résidus 319-541) et ses mutants ont été synthétisés (GenScript), fusionnés avec le fragment IgG1 Fc humain et clonés dans le vecteur d'expression de mammifère pSecTag. Le plasmide a été transfecté dans des cellules HEK Expi293 et ​​incubé à 37°C pendant quatre jours. Le surnageant a été récolté pour une purification supplémentaire par la résine de protéine G selon le protocole du fabricant.

Tri de cellules individuelles de cellules B de mémoire de liaison RBD ou S-ECD

La protéine S-ECD (GenScript) exprimée et purifiée à partir de cellules d'insectes Sf9 infectées par un baculovirus recombinant a été biotinylée chimiquement à l'aide du kit EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo Fisher Scientific) selon les instructions du fabricant. Le RBD marqué par Avi exprimé dans des cellules d'insecte Sf9 infectées par un baculovirus et le S-ECD marqué par Avi exprimé dans des cellules HEK293T de mammifère (Kactus Biosystems) ont été biotinylés à l'aide du kit BirA Biotin-Protein Ligase (Avidity). L'excès de biotine non liée a été éliminé en utilisant la colonne Zeba Spin Desalting (Thermo Fisher Scientific). Pour chaque échantillon, la protéine d'appât-PE et la protéine d'appât-APC ont été préparées en incubant 3 μg de RBD biotinylé ou 25 μg de protéines S-ECD biotinylées avec de la streptavidine-PE (eBioscience) ou de la streptavidine-APC ( BD Biosciences), respectivement.

La purification des cellules B, le marquage à deux colorants fluorescents des cellules B liant les protéines d'appât et des expériences de tri de cellules individuelles ont été effectuées comme décrit précédemment (Escolano etਊl., 2019 Robbiani etਊl., 2017 Wang etਊl., 2020b ). En bref, les PBMC décongelées et lavées avec du milieu RPMI ont été incubées avec des microbilles CD19 (Miltenyi Biotec) pour une sélection positive des lymphocytes B.Incubation séquentielle à 4ଌ avec bloc Fc humain (BD Biosciences), protéine d'appât-PE/APC (10 μg/ml pour RBD, 60 μg/ml pour S-ECD) et anti-CD20- PECy7 (BD Biosciences) a été effectué, suivi du tri monocellulaire de CD20-PECy7 + protéine d'appât-PE + protéine d'appât-APC + cellules B mémoire dans des plaques de 96 puits à l'aide d'un FACSAria II (BD Biosciences). Les cellules B triées à une seule cellule ont été stockées à �ଌ.

Clonage, séquençage et production d'anticorps

Le clonage d'anticorps à partir des cellules individuelles triées et la production d'anticorps monoclonaux ont été effectués comme indiqué précédemment ( Robbiani etਊl., 2017 Wang etਊl., 2020b ). Les séquences d'amorces pour le 1 er / 2 ème tour de PCR nichée ont été répertoriées dans le tableau S2. Les produits de PCR amplifiés de chaque cellule ont été chargés sur un gel d'agarose à 2 % pour l'électrophorèse et purifiés pour le séquençage de Sanger. Tous les résultats de séquençage des chaînes lourdes et légères kappa/lambda ont été analysés par IMGT/V-QUEST ( Brochet etਊl., 2008 ) et IgBlast ( Ye etਊl., 2013 ), et le segment du gène V(D)J et les séquences CDR3 de chaque anticorps ont été déterminées. Les anticorps sélectionnés ont été soumis à la construction de vecteurs et à l'expression d'anticorps comme décrit précédemment (von Boehmer etਊl., 2016).

Analyse de clustering

Les activités relatives de la luciférase mesurées dans les tests de neutralisation ou d'ADE ou les deux ont été utilisées pour une analyse de clustering hiérarchique non supervisée avec le langage de script statistique R, en utilisant des données transformées en log, des coefficients de corrélation euclidienne pour une métrique de distance et le clustering ward.D2. Une carte thermique et un arbre de dendrogramme de cluster ont été créés à l'aide des packages R Pretty Heatmaps (pheatmap et hclust).

Quantification et analyse statistique

Les résultats détaillés de l'analyse statistique sont présentés dans les légendes des résultats et des figures. Le test de Shapiro-Wilk et le test F de Fisher ont été utilisés pour vérifier la normalité et l'homogénéité des variances, respectivement, avant d'effectuer la comparaison. Le test Student&# x02019s t a été effectué pour RBD ELISA (Figureਁ A), tandis que le test Wilcoxon Rank Sum a été utilisé pour d'autres ELISA (Figures 1 B�) et des comparaisons de l'ADE AUC (Figureਇ E) en raison de leur non- distribution normale. Afin de déterminer s'il existe une différence statistiquement significative entre l'ADE AUC et l'IC50 des valeurs des anticorps Cluster-X, -Y et -Z, le test non paramétrique (comparaison multiple de Dunn&# x02019s Kruskal-Wallis) a été effectué (figures 7 B et 7C). Le test exact de Fisher a été effectué pour évaluer la signification statistique sur la base de la distribution exacte des fréquences des anticorps du groupe IV du RBD dans trois groupes d'anticorps (Figure&# x000a07 D). La corrélation a été évaluée par la méthode de corrélation des rangs de Spearman (Figures S6E–S6G). L'aire sous les courbes ELISA (ELISA AUC) ( Figures 1 A� et ​ et 3A�), 3 A�), le titre neutralisant demi-maximal (NT50) pour les tests de neutralisation sérique ( Figures 1 F&# x020131H), la concentration inhibitrice de 50 % (IC50) valeurs calculées pour les capacités de neutralisation des anticorps (Figures 4 A, 4F et ​ et 5C), 5 C), l'aire sous la courbe ADE (ADE AUC) (Figureਆ C) et les valeurs de puissance d'amélioration (Figure S6D ) ont été calculés dans le logiciel PRISM comme indiqué précédemment ( Bardina etਊl., 2017 Robbiani etਊl., 2019 Wang etਊl., 2020b ).


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