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Comment fonctionne l'assemblage d'extrémités non homologues (NHEJ) ?


Je lisais sur la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) dans mon manuel de biologie moléculaire du gène, mais l'explication fournie dans le texte était plutôt vague pour moi et je n'étais pas capable de la comprendre complètement. J'ai compris que NHEJ peut être utilisé comme mécanisme de réparation lorsque des cassures double brin dans l'ADN se produisent. Les deux extrémités cassées sont ensuite réunies. Ce que je n'ai pas compris, c'est comment cela se fait. Les deux extrémités cassées n'auront pas toujours des bases complémentaires alors, cela ne conduira-t-il pas à des bases dépareillées ? Comment ce problème est-il résolu ? J'ai vraiment besoin d'une explication détaillée de la façon dont NHEJ se produit s'il vous plaît.


La jonction d'extrémités non homologues induit en effet des erreurs dans la séquence affectée. Mais vous devez garder à l'esprit que le NHEJ est un mécanisme de réparation d'urgence qui implique une chance de "réparer ou mourir". Si la rupture chromosomique n'est pas réparée, il n'est pas improbable que la cellule entre en apoptose ou, pire encore, se développe en une cellule cancéreuse. L'introduction de petites erreurs est un prix relativement faible par rapport à cela, bien que cela puisse encore perturber les gènes ou les séquences régulatrices. Pour le mécanisme regardez sur la figure (de la première référence) :

Pour en savoir plus, consultez l'article de Wikipédia sur le NHEJ et/ou les références suivantes :

  1. Le mécanisme de la jonction des extrémités de l'ADN non homologue humain.
  2. Le mécanisme de réparation des cassures de l'ADN double brin par la voie de jonction des extrémités de l'ADN non homologue.

NHEJ est en effet sujet aux erreurs. Il est appelé "non homologue" car il n'utilise pas de matrice "homologue" provenant d'un autre morceau d'ADN correspondant à la séquence pour guider la réparation. Les réparations homologues évitent de provoquer des mutations car la chaîne d'ADN similaire agit comme un modèle afin que la cellule sache quelles lettres mettre dans l'espace. Quand il n'y a pas de modèle, il n'y a aucun moyen pour la machine de réparation de savoir quelles lettres spécifiques utiliser… d'où les mutations dans NHEJ.

Fait intéressant, ce phénomène NHEJ est utilisé pour piloter l'état de l'art actuel en génie génétique : les endonucléases guidées par l'ARN CRISPR/Cas9. Si vous provoquez une rupture d'ADN double brin près du début de la séquence codant pour la protéine d'un gène, cette rupture sera réparée avec NHEJ, provoquant une mutation "indel" (insertion ou suppression). L'insertion ou la suppression de lettres dans la séquence codante d'un gène provoquera un "décalage de cadre" où les codons à 3 lettres qui indiquent à la cellule quels acides aminés utiliser se mélangent tous parce que le 3-3-3-3-3- normal Le motif 3-3 est perturbé. De cette façon, nous pouvons désactiver les gènes que nous voulons cibler : il suffit de provoquer un décalage du cadre dans ce gène avec CRISPR.

Si nous voulons INSÉRER quelque chose en utilisant l'édition du génome, nous avons besoin d'une "réparation dirigée par homologie" - nous donnerons le CRISPR à côté d'une autre chaîne de nucléotides qui correspond aux chaînes qui flanquent l'endroit que nous coupons, avec une nouvelle séquence au milieu. Ainsi, lorsque CRISPR effectuera la coupe, notre gabarit homologue collera aux côtés de la coupe et la pièce centrale fournira à la cellule un plan pour l'insertion ou la modification que nous souhaitons effectuer.

Ainsi, vous verrez en y réfléchissant que l'"homologie" qui manque à NHEJ est le brin utilisé comme matrice de réparation, et en manipulant ces processus naturels de réparation de l'ADN qui peuvent ou non utiliser des matrices homologues, nous avons un méthode possible pour activer, désactiver, modifier ou insérer des gènes. Cela signifie que NHEJ n'est plus seulement un processus biologique : c'est une technique d'ingénierie.


Effet du déficit en Ku86 et en DNA-PKcs sur la jonction d'extrémité non homologue et la recombinaison homologue à l'aide d'un test de transfection transitoire

Dans les cellules de mammifères, les cassures double brin de l'ADN sont réparées par une jonction d'extrémités non homologue et une recombinaison homologue, les deux voies étant essentielles pour le maintien de l'intégrité du génome. Nous avons déterminé l'effet des mutations dans Ku86 et DNA-PK sur l'efficacité et la précision de la réparation des cassures double brin par jonction d'extrémités non homologues et recombinaison homologue dans les cellules de mammifères. Nous avons utilisé un test, basé sur la transfection transitoire d'un ADN plasmidique linéarisé, conçu pour détecter simultanément des marqueurs de transfection et de recombinaison. En accord avec les résultats précédents, la jonction terminale non homologue a été largement compromise dans les cellules déficientes en Ku86 et est revenue à la normale dans la lignée cellulaire isogénique complétée par Ku86. En outre, l'analyse des plasmides d'ADN récupérés à partir de cellules mutantes Ku86 a montré une utilisation accrue de microhomologies aux jonctions d'extrémité non homologues et a affiché une fréquence significativement plus élevée d'insertions d'ADN par rapport aux cellules témoins. D'autre part, les lignées cellulaires déficientes en ADN-PKcs ont montré une réparation efficace des cassures double brin par les deux mécanismes.


1. Introduction

Les cassures double brin de l'ADN (DSB) constituent la forme la plus cytotoxique de dommages à l'ADN dans le génome. Les DSB sont générés non seulement par des sources exogènes, telles que les rayonnements ionisants, les composés radiomimétiques et les inhibiteurs de la topoisomérase, mais également par des processus cellulaires endogènes qui génèrent des espèces réactives de l'oxygène [1, 2]. Dans les cellules de mammifères, l'une des principales voies de réparation des DSB est la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) [3, 4]. Les principales protéines qui participent à cette voie de jonction finale de l'ADN à la fois in vitro [5𠄷] et in vivo [8&# x0201310] sont l'hétérodimère Ku 70/80, DNA-PKcs, XRCC4, DNA ligase IV et XLF (XRCC4-like factor également appelé Cernunnos) qui a récemment été identifié comme un partenaire de liaison du complexe DNA ligase IV-XRCC4 et comme nécessaire pour une ligature efficace via NHEJ [11, 12]. Des sous-ensembles de NHEJ peuvent impliquer d'autres facteurs tels que Artemis [13]. Avec la protéine Artemis, l'ADN-PKcs peut stimuler le traitement des extrémités de l'ADN [14, 15]. Protéines supplémentaires, y compris les ADN polymérases μ et λ, TDP1 (tyrosyl-ADN phosphodiestérase), PNK (polynucléotide kinase) et WRN (syndrome de Werner hélicase) sont également susceptibles de jouer un rôle dans la réparation des DSB [16]. Des rapports récents suggèrent que de nombreuses autres protéines, y compris ATM, les histones H1 et H2AX, NBS1 et Mre11 peuvent également avoir une certaine influence sur la voie NHEJ [17�]. NHEJ est un processus complexe en plusieurs étapes initié par la liaison d'un complexe hétérodimérique composé de sous-unités Ku70 et Ku80 (codées par les gènes XRCC5 et XRCC6, respectivement) aux deux extrémités de la molécule d'ADN brisée avec une spécificité et une affinité élevées [20]. Ku se lie aux extrémités de l'ADN DSB et recrute l'ADN-PKcs, qui est une sérine/thréonine protéine kinase de 460 kDa, jusqu'aux extrémités [21]. Ku se déplace ensuite vers l'intérieur, environ 14𠂛p sur l'ADN, permettant à l'ADN-PKcs contacter l'ADN [22]. L'holoenzyme ADN-PK résultante (Ku/ADN-PKcs) a une activité sérine/thréonine protéine kinase qui est nécessaire pour une réparation efficace [23]. Un modèle actuel de NHEJ suggère que la translocation vers l'intérieur de Ku permet aux molécules d'ADN-PKcs sur les extrémités opposées du DSB d'interagir à travers le DSB et de former un pont moléculaire ou une synapse entre les deux extrémités de l'ADN [24], et la jonction des extrémités peut puis être complétée par la ligature des extrémités d'ADN par le complexe ADN ligase IV/XRCC4/XLF [25].

Par conséquent, l'ADN-PK a des rôles importants dans NHEJ qui incluent son activité de pontage terminal de l'ADN [24], et sa fonction dans la régulation des enzymes de traitement final DSB, telles que la nucléase dépendante de la structure Artemis [15] et son exigence pour le recrutement stable du complexe ADN ligase IV/XRCC4 [26]. À l'appui de ce modèle NHEJ dépendant de l'ADN-PK, des études antérieures ont montré que l'ADN-PK se lie à la XRCC4-ligase IV [26, 27], mais pas aux autres ADN ligases de mammifères (I ou III) in vitro [28]. Il a également été montré que la wortmannine, un inhibiteur chimique de l'ADN-PK, [29] inhibe la NHEJ [5] d'une manière similaire à celle observée dans les cellules exprimant l'ADN-PK déficiente en kinase.cs [23]. Cependant, le rôle de l'activité ADN-PK kinase dans NHEJ n'a pas encore été entièrement compris. Bien que l'ADN-PKcs se lie à Ku au niveau des sites ADN DSB, la rupture de ces complexes ADN-PK par autophosphorylation [30, 31] est nécessaire pour la ligature ultérieure des extrémités de l'ADN [32, 33]. Il a été établi que la protéine kinase dépendante de l'ADN (ADN-PK) subit une série d'événements d'autophosphorylation qui facilitent la réussite de la jonction d'extrémités non homologues [32]. ADN-PKcs est phosphorylé sur plusieurs sites in vivo en réponse aux dommages à l'ADN, y compris la sérine 2056 [34], un groupe de sites entre les résidus 2609� (appelé groupe ABCDE ou Thr-2609) et la thréonine 3950 [35]. Bien que l'ADN-PKcs dans lequel les sites ABCDE ont été mutés en alanine a une activité protéine kinase normale, sa capacité à se dissocier du complexe Ku-ADN est réduite in vitro [36] et in vivo [37], suggérant que la phosphorylation des sites ABCDE joue un rôle majeur dans la régulation du désassemblage du complexe ADN-PK initial. L'ADN-PK phosphoryle également les sous-unités Ku [38] et XRCC4 [39], mais la mutation de ces sites de phosphorylation n'inhibe pas NHEJ [26, 40]. Il a été suggéré que l'activation de la kinase pourrait être nécessaire pour la mobilisation du complexe ADN ligase IV/XRCC4 [41], mais le mécanisme de mobilisation est inconnu. Il a également été suggéré que la phosphorylation de l'histone H1 par l'ADN-PK, qui réduit l'affinité de l'histone pour l'ADN, est nécessaire pour NHEJ [42]. Alternativement, il a également été proposé que l'ADN-PKcs stimule, mais n'est pas essentiel à, NHEJ [10, 18]. Des études récentes ont révélé l'architecture structurelle globale de l'ADN-PKcs et Ku avec de l'ADN dans des conditions qui imitent les DSB et l'ADN-PKcs autophosphorylation [43]. Les résultats indiquent qu'une association et une dissociation efficaces de l'ADN-PKcs aux DSB est régulé par Ku et DNA-PKcs autophosphorylation qui induit des changements conformationnels dramatiques dans la protéine. Récemment, une structure cristalline tridimensionnelle d'ADN-PK purifiécs en complexe avec des fragments C-terminaux de Ku80 a été déterminé et révèle des régions irrégulières de structures répétitives (α-répétitions HEAT hélicoïdales) qui pourraient fournir un berceau flexible pour favoriser la réparation de l'ADN DSB [44]. En théorie, les événements de phosphorylation individuels ont des effets différents sur l'ADN-PKcs structure et fonction, à la fois in vitro et in vivo, qui à son tour influence l'assemblage et le désassemblage du complexe NHEJ initial qui régule l'accessibilité du DSB à d'autres facteurs de réparation ainsi que la progression de la voie [3, 33, 45]. La voie dépendante de l'ADN-PK pourrait ainsi être caractérisée comme la principale voie NHEJ qui emploie les produits de l'ADN-PKcs, Ku70/80, ADN ligase IV, XRCC4, XLF et Artemis. Des défauts dans les composants de cette voie ont été impliqués dans l'instabilité génomique et le développement du cancer [46, 47]. La possibilité cependant de la présence de voies alternatives pour NHEJ a été suggérée par les premières expériences dans lesquelles les cellules déficientes en ADN-PKcs, Ku, DNA ligase IV ou XRCC4 ont montré un potentiel élevé de jonction terminale avec une utilisation préférentielle des microhomologies [48]. La présence d'au moins une voie alternative a d'abord été indiquée par l'observation que les cellules MO59J mutantes ADN-PK, qui n'expriment pas l'ADN-PKcs, conservent la capacité de réparer les DSB d'ADN [8] et présentent une activité de jonction terminale de type sauvage in vitro [49], suggérant l'implication d'une voie de terminaison indépendante de l'ADN-PK dans ces cellules. Au moins deux mécanismes NHEJ ont également été identifiés dans des cellules avec DNA-PKcs  in vivo: un assemblage d'extrémité immédiat et haute fidélité qui se produit dans les deux heures, suivi d'une réparation DSB sujette aux erreurs avec une cinétique plus lente [49, 50]. Une étude de lignées cellulaires avec et sans DNA-PKcs, M059K et M059J, respectivement, suggèrent que la première voie NHEJ plus rapide est l'ADN-PKcs-dépendante et la seconde voie NHEJ, plus lente, est l'ADN-PKcs-indépendant [51, 52]. Une réparation dépendante et indépendante de l'ADN-PK a également été indiquée in vivo en fonction du cycle cellulaire [53]. Des études récentes ont confirmé le fonctionnement de voies alternatives de NHEJ en l'absence du complexe ADN-PK/LigIV/XRCC4, dans lequel une autre ligase se substitue partiellement à l'ADN ligase IV [54, 55]. Bien que Polβ, XRCC1, PARP-1 et l'ADN ligase III contribuent principalement à la réparation par excision de base (BER) et à la réparation SSB [56], ces protéines sont également considérées comme des composants candidats pour les voies de sauvegarde pour NHEJ dans lesquelles la ligase III fournit l'activité de ligature majeure [57, 58]. En effet, il a été démontré que PARP-1 est en compétition avec Ku pour la réparation des cassures double brin de l'ADN, mais apparemment via des voies NHEJ distinctes [59]. Ces voies de sauvegarde ne sont généralement pas détectables en présence d'ADN-PKcs, suggérant que la liaison de la protéine à l'ADN inhibe la NHEJ indépendante de l'ADN-PK [49, 54]. Un travail plus récent a identifié l'histone H1 comme un facteur putatif supplémentaire qui opère préférentiellement au sein de ces voies de sauvegarde [60]. Bien qu'il existe des preuves importantes in vivo et in vitro d'un ADN-PKcs-voie NHEJ indépendante, ce mécanisme de terminaison de l'ADN n'a été rapporté que in vitro en l'absence de la sous-unité kinase en raison de l'inhibition apparente des voies alternatives par l'ADN-PKcs [54]. Dans cette étude, nous avons identifié in vitro conditions de réaction qui optimisent la réparation des DSB d'ADN via une voie indépendante de l'ADN-PK en présence d'ADN-PK fonctionnelcs. Nous avons également évalué l'efficacité de la jonction terminale DSB et l'activité DNA-PK dans des extraits traités avec de la wortmannine, qui est un inhibiteur puissant et sélectif des phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) ainsi que de l'ADN-PK de type PI3K et a un effet prononcé sur Réparation de l'ADN DSB [61, 62]. Dans ces mêmes conditions, nous avons trouvé que la DNA-PK est active en l'absence de wortmannine et inhibée en présence de wortmannine mais que l'inhibition de l'activité kinase de la DNA-PK n'inhibe pas la NHEJ. Les résultats confirment également que dans des conditions de réaction qui favorisent la NHEJ dépendante de l'ADN-PK, la wortmannine inhibe complètement la jonction des extrémités de l'ADN. Nous avons constaté que les activités individuelles des deux voies de réparation NHEJ sont différemment affectées par les conditions de réaction. De plus, comme en témoignent des études antérieures [49, 50], nous avons observé une diminution de la fidélité de réparation des DSB dans des conditions de réaction qui favorisent la NHEJ indépendante de l'ADN-PK.


Résultats et discussion

Immunodéplétion des protéines Mre11 et Ku70 de X. laevis extraits d'oeufs

Nous avons étudié les conséquences de l'inactivation de Mre11 sur NHEJ en appauvrissant la protéine Mre11 à partir d'extraits acellulaires avec un sérum polyclonal spécifique de X. laevis Protéine Mre11 (anti-XMre11). Nous avons précédemment utilisé ces anticorps pour démontrer que l'ADN génomique accumule les DSB lors de la réplication de l'ADN dans des extraits appauvris en Mre11 (Costanzo et al., 2001). De plus, l'épuisement de Mre11 altère considérablement la réponse dépendante de l'ATM (Axatia télangiectasie mutée) aux DSB (Costanzo et al., 2004). Surtout, nous montrons que le premier défaut est sauvé par l'allèle hypomorphe ATLD3/4 Mre11, alors que l'activation ATM ne l'est pas (Costanzo et al., 2004). Cela démontre clairement que l'activité associée à Mre11 reste dans les cellules ATLD. Nous avons utilisé deux types d'extraits acellulaires pour notre étude et avons établi que le cytosol d'œuf et le cytosol d'œuf sans membrane supportaient le NHEJ avec une efficacité similaire (voir les figures 2 et ​ et 4 4 ).

Mre11 n'est pas requis pour un NHEJ efficace. (A) Caractérisation représentative du gel teinté à l'or SYBR des produits NHEJ pour les types de substrats non correspondants 3 &# x02032-PSS (voies 5 &# x0201315) et extrémité émoussée + 3 &# x02032-PSS (voies 16 &# x0201326). Les pistes 5 et 16 montrent 10 ng de substrats d'entrée SacI-KpnI et SacI-SmaI, respectivement. L'entrée en piste 2 correspond à 10 ng de pBS KS II non digéré. mt, ADN mitochondrial de X. laevis extrait M, formes multimères supérieures LD, dimère linéaire LM, monomère linéaire (substrat) CC, cercle fermé. (B) L'intensité des bandes correspondant aux produits NHEJ a été quantifiée à l'aide du système FluorImager pour chaque réaction NHEJ dans des extraits appauvris en Ku70 et Mre11 et a été exprimée en pourcentage d'efficacité de réparation (voir Résultats). L'étiquetage sur l'axe des x fait référence au type de substrat NHEJ comme indiqué dans le tableau SI (disponible sur http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200506029/DC1).

La cinétique du NHEJ n'est pas affectée par la déplétion de Mre11. Le substrat non apparié 3′-PSS SacI-KpnI a été incubé dans du cytosol sans membrane appauvri fictif et Mre11, et des échantillons ont été prélevés aux moments indiqués. L'ADN a été récupéré et analysé par (A) essai de formation de colonies et (B) hybridation Southern blot (le regroupement de différents segments du même gel est indiqué par des lignes de division).

La protéine Mre11 a été éliminée quantitativement par deux cycles d'immunodéplétion et n'était plus détectable par Western blot (Fig. 1 A, voies 2 & 020135 et B). L'épuisement de Mre11 n'a pas affecté le niveau de protéine Ku70 (Fig. 1 A, voies 2&# x020135). Inversement, les niveaux de protéine Mre11 n'ont pas été réduits par l'épuisement de Ku70 (Fig. 1 A, voies 6&# x020139). Cela démontre qu'il n'y a pas d'interaction significative entre les deux protéines en solution, et cela permet l'analyse indépendante des extraits appauvris en Mre11 et Ku70. De plus, les protéines Mre11 et Ku70 peuvent être épuisées simultanément à partir d'extraits d'œufs (Fig. 1 C).

Immunodéplétion des protéines Mre11 et Ku70 de X. laevis extraits d'oeufs. (A) Le cytosol d'œuf non traité et les extraits fictifs, appauvris en Mre11 ou en Ku70 ont été analysés par Western blot avec du sérum anti-XMre11 ou des anticorps contre Ku70. (B) Le cytosol d'œuf sans membrane non traité et les extraits traités avec du sérum pré-immun (mock appauvri) ou anti-XMre11 (Mre11 appauvri) ont été analysés par Western blot avec du sérum anti-XMre11. (C) Le cytosol d'œuf doublement appauvri de Mre11 et Ku70 (Mre11 et Ku70 appauvri) ont été analysés avec du sérum anti-XMre11 ou des anticorps contre Ku70. (D) Des extraits de cytosol d'œuf non traité, de Mre11 ou de Mre11 et de Ku70 ont été incubés avec des billes de streptavidine recouvertes d'ADN double brin linéaire biotinylé, et la fraction de protéines liées à l'ADN a été analysée par Western blot avec anti-XMre11 sérum.

Tous les dosages ont été effectués après deux cycles d'immunodéplétion. L'étendue de l'épuisement de Mre11 a été évaluée en incubant 20 μl d'extraits appauvris avec des molécules d'ADN biotinylées linéaires immobilisées sur des billes de streptavidine. La fraction totale des protéines liées à l'ADN a ensuite été extraite et analysée par Western blot. Aucun signal de protéine Mre11 n'a été détecté dans les extraits appauvris en Mre11 ou Mre11 et Ku70 par rapport au cytosol d'œuf non traité (Fig. 1 D).

Mre11 n'est pas requis pour un NHEJ efficace

Les extraits appauvris en Mre11 et Ku70 ont été testés pour l'activité NHEJ. L'épuisement de Ku70 a fourni un contrôle pour l'élimination d'une protéine requise pour NHEJ (Fig. 2, A et B). Neuf substrats NHEJ différents ont été générés en digérant le plasmide pBS KS II avec une ou deux enzymes de restriction différentes pour produire des molécules d'ADN linéaires (tableau SI, disponible sur http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200506029 /DC1). Les substrats NHEJ ont été incubés individuellement dans des extraits à une concentration finale de 1 ng/μl, et des échantillons ont été prélevés à 0 et 150 min. Lors de l'incubation dans des extraits de contrôle (Fig. 2A, cytosol d'œuf non traité et extraits appauvris simulés), les molécules linéaires ont subi une NHEJ intramoléculaire efficace, générant des cercles fermés de manière covalente (CC). Les CC étaient le produit NHEJ prédominant dans les extraits de contrôle (Fig. 2 A et Fig. S1). En plus de la recircularisation, la jonction intermoléculaire des substrats linéaires a généré des produits mineurs : des dimères linéaires (LD) ainsi que des formes multimères supérieures (collectivement désignées par M). L'épuisement de Ku70 a considérablement altéré la jonction intramoléculaire des extrémités, et les formes CC n'ont pas été détectées (Fig. 2A, pistes 10, 11, 21 et 22). Comme décrit précédemment (Labhart, 1999), la multimérisation des substrats linéaires a été favorisée dans ces extraits. Ce modèle de circularisation réduite et de formation accrue de multimères après l'épuisement de Ku70 a été observé avec tous les substrats NHEJ (données non publiées). Ensuite, nous avons évalué si l'activité catalytique de l'ADN-PK était requise en utilisant NU7026, un inhibiteur spécifique de l'ADN-PKcs (Hollick et al., 2003). Nous avons constaté que la jonction intramoléculaire des extrémités était inhibée à des doses aussi faibles que 0,5 μM, tandis que la jonction intermoléculaire était inhibée à 25 μM NU7026 (Fig. S2, disponible sur http://www.jcb.org/cgi/content /full/jcb.200506029/DC1). Nos résultats suggèrent que l'ADN-PKcs est également nécessaire pour NHEJ. En revanche, le profil de formation du produit NHEJ n'a pas été affecté par l'épuisement de Mre11 et ne pouvait être distingué de celui des extraits non traités et appauvris de manière fictive. En l'absence de protéine Mre11, les substrats linéaires ont été efficacement convertis en produits NHEJ (Fig. 2A, pistes 14, 15, 25 et 26). Cela suggère fortement que Mre11 est indispensable pour la réparation NHEJ de ces substrats.

Pour découvrir tout rôle possible de la structure terminale de l'ADN dépendant de Mre11 dans NHEJ, nous avons déterminé l'efficacité de réparation pour chaque substrat NHEJ dans des extraits appauvris en Ku70 ou Mre11. L'efficacité de la réparation a été définie comme le rapport entre le produit recircularisé (CC) et l'ADN total (produits NHEJ et substrat restant) et a été exprimée en pourcentage de l'efficacité correspondante dans les extraits appauvris simulés (Fig. 2 B, pourcentage d'efficacité de réparation). Nous avons utilisé la formation de produit circulaire par jonction intramoléculaire comme mesure pertinente de l'activité NHEJ dans l'extrait, car la formation de CC dépend de Ku70 et de l'ADN-PKcs (Fig. S2 Labhart 1999). En l'absence de Ku70, l'efficacité de la réaction de réparation a été réduite à zéro pour tous les substrats NHEJ (Fig. 2 B), y compris le monocaténaire cohésif 5′ (PSS) digéré avec EcoRI ou BamHI (données non publiées), qui diffère d'une étude précédente (Labhart, 1999). En revanche, l'efficacité de réparation moyenne dans les extraits appauvris en Mre11 était de 95,1% de la valeur correspondante dans les extraits appauvris simulés, indiquant ainsi que toutes les réactions sont très efficaces en l'absence de Mre11 (Fig. 2 B). Des résultats similaires ont été obtenus lorsque les réactions NHEJ ont été caractérisées par hybridation Southern blot (figure S1). Dans l'ensemble, nos données établissent que Mre11 n'est pas nécessaire pour un NHEJ efficace dans X. laevis extrait acellulaire quel que soit le type de substrat.

Ensuite, nous avons déterminé si la formation de produits intermoléculaires (dimères et multimères) observés préférentiellement après l'épuisement de Ku70 nécessitait Mre11. À cette fin, nous avons épuisé Ku70 et Mre11 simultanément ( Fig. 1 C). La formation de produits NHEJ intermoléculaires (LD et M) dans les extraits appauvris en Ku70 (Fig. 3A, piste 8) n'a pas été inhibée après une nouvelle déplétion de Mre11 (Fig. 3A, piste 12). Ensemble, ces données montrent que Mre11 n'est pas requis pour la formation de produits intramoléculaires (CC) ou intermoléculaires (LD et M).

L'épuisement de Mre11 n'affecte pas la génération de multimères médiée par NHEJ. (A) Analyse par transfert de Southern des produits NHEJ générés par l'incubation de l'extrémité émoussée + substrat 5 & # x02032-PSS dans les extraits de cytosol d'œufs appauvris indiqués à une concentration d'entrée de substrat de 0,1 (gauche), 1 (milieu) ou 10 (droite) ng/μl. Les données dans le panneau de gauche sont dérivées de deux segments du même gel (comme indiqué par la ligne de séparation). (B) L'extrémité franche + le substrat 5′-PSS a été incubé à 1 ng/μl dans du cytosol d'œuf non traité qui avait été complété par le complexe MRN recombinant, et les produits NHEJ ont été analysés par hybridation Southern blot. M, formes multimères supérieures LD, dimère linéaire LM, monomère linéaire (substrat) CC, cercle fermé OC, cercle ouvert.

Ensuite, nous avons modifié le rapport molaire des protéines et de l'ADN substrat et surveillé les conséquences sur la jonction des extrémités. Nous avons d'abord comparé les conséquences de l'élimination de Mre11 à différentes concentrations de substrat NHEJ. Nous n'avons trouvé aucune différence significative entre les contrôles et les extraits appauvris en Mre11 lorsque les extraits ont été incubés avec 0,1, 1 ou 10 ng/μl de substrat NHEJ (Fig. 3 A). À la concentration plus élevée d'ADN, nous avons constaté qu'un facteur NHEJ était limitant car seule une fraction de la matrice était réunie. De plus, la distribution des produits de jonction finale n'était pas altérée lorsque NHEJ était surveillé dans des extraits supplémentés avec le complexe MRN recombinant à une concentration finale jusqu'à trois fois le niveau du complexe MRN endogène (Fig. 3 B).

Des études in vitro récentes sur HeLa et S. cerevisiae ont rapporté une interaction de stimulation directe entre le complexe MRN et les composants centraux du NHEJ (Chen et al., 2001 Huang et Dynan, 2002). De plus, des études sur des extraits de cellules de mammifères fractionnés ont montré que les extraits dans lesquels l'activité Rad50 était inhibée étaient défectueux dans la jonction terminale intermoléculaire (Zhong et al., 2002). contrairement à X. laevis extraits, ces extraits acellulaires de mammifères ne supportent pas la jonction intramoléculaire des extrémités, comme le montre la formation exclusive de dimères et de multimères supérieurs résultant de la ligature intermoléculaire. De plus, des extraits acellulaires de X. laevis les œufs diffèrent d'un système in vitro ou d'un extrait cellulaire fractionné en ce qu'ils contiennent toutes les protéines cytosoliques et nucléaires normalement présentes dans une cellule. Ces extraits prennent en charge l'assemblage régulé de la chromatine, la réplication, la recombinaison et la réparation de l'ADN, et ils ne sont pas limités en termes de taux pour les protéines participant à ces fonctions.

Il est important de noter que l'inhibition de l'activité Ku70 favorise la jonction intermoléculaire (figures 2A et 3A Labhart 1999). Cela suggère que les multimères sont formés par une voie indépendante de Ku70 rappelant ce qui a été récemment décrit dans les cellules de mammifères (Wang et al., 2003). Dans X. laevis, la voie indépendante de Ku70 menant à la formation de LD et de multimères est également indépendante de Mre11, car des produits intermoléculaires sont toujours générés dans des extraits appauvris à la fois en Ku70 et en Mre11 (Fig. 3 A).

La cinétique des réactions d'extrémité n'est pas affectée par l'épuisement de Mre11

Les expériences susmentionnées n'ont pas complètement exclu qu'une voie alternative NHEJ indépendante de Mre11 puisse remplacer l'absence de Mre11. Pour découvrir une voie hypothétique indépendante de Mre11, nous avons comparé la cinétique de la jonction des extrémités, en supposant que différentes voies afficheraient des cinétiques différentes. Nous avons surveillé l'activité NHEJ dans des extraits de Mre11 et appauvris à des moments différents au cours de la réaction. Le substrat NHEJ ne correspondant pas au 3′-PSS a été incubé dans du cytosol d'œuf sans membrane et des échantillons ont été prélevés à 0, 0,5, 1, 5, 15, 30, 60 et 120 min. Les produits réparés ont ensuite été purifiés et testés dans le test de formation de colonies. L'activité transformante associée à chaque échantillon était une lecture de l'activité NHEJ intramoléculaire (formation de produit circulaire). Au temps = 0, aucune colonie n'a été obtenue à partir d'échantillons d'extraits appauvris en Mre11 ou en maquette, confirmant ainsi que toutes les molécules de substrat dans l'ADN d'entrée étaient linéaires (Fig. 4 A). Des produits de réparation ont été générés dès 0,5 min dans des extraits appauvris en Mre11 et en maquette. De plus, le cytosol d'œuf sans membrane était capable de supporter la jonction des extrémités avec une cinétique similaire en présence ou en l'absence de Mre11. Des résultats similaires ont été obtenus lorsque la cinétique de jonction des extrémités a été surveillée par analyse de transfert de Southern (figure 4B). Nous concluons que Mre11 n'est pas requis pour le NHEJ rapide observé dans les extraits.

Mre11 n'est pas requis pour une ligature précise des extrémités de l'ADN

Ensuite, nous avons examiné la fidélité des réactions de jonction terminale dans des extraits appauvris en Mre11 et fictifs en séquençant les jonctions des produits NHEJ clonés. Nous avons constaté que tous les substrats NHEJ étaient religués sans réarrangements bruts (tableau I). Ceci est en accord avec une étude précédente (Pfeiffer et Vielmetter, 1988). Le mode de jonction spécifique a été déterminé par la configuration terminale du substrat NHEJ. Les extrémités avec des 5' ou 3' 3'PSS cohésives ainsi que les extrémités franches ont toujours été religaturées sans perte nette de nucléotides. Les substrats 3′-PSS non correspondants ont été joints après l'alignement des extrémités qui a permis l'appariement de bases le plus efficace. Lorsqu'aucun appariement de base n'a pu se produire entre les extrémités partenaires (extrémité franche + 5′-PSS, extrémité franche + 3′-PSS, 5′-PSS + 3′-PSS, et complètement sans correspondance 5′-PSS) , les PSS étaient généralement préservés par synthèse d'ADN de remplissage. Des ajouts occasionnels de nucléotides, principalement des résidus d'adénosine ou de thymidine, et des pertes de nucléotides, qui pourraient être causées par des événements de rognage exonucléolytiques, ont été observés. Ces événements ont contribué à la variété et à la complexité de la formation des jonctions (tableau I). À l'exception de quelques types de jonctions qui se sont produits très rarement, le spectre des produits de jonction formés dans les extraits appauvris en Mre11 était presque identique à celui obtenu dans les extraits appauvris simulés. De plus, la fréquence à laquelle ces types de jonctions ont été formés n'a pas été modifiée dans les extraits dépourvus de protéine Mre11 (tableau I). En résumé, ces données suggèrent que Mre11 n'est pas nécessaire pour un NHEJ précis dans X. laevis extraits d'œufs et ne biaise pas l'assemblage vers un type spécifique de jonction.

Tableau I.

Type de substrat NHEJSéquence de terminaisonRejoindre l'intermédiaire a Produit d'assemblageContrôler-Mre11
Extrémités franches (EcoRV)5′-GAT ATC-3′
3′-CTA TAG-5′
5′-GATATC-3′
3′-CTATAG-5′
5′-GATATC-3′
3′-CTATAG-5′
1 (8/8)1 (8/8)
Cohésif 5′-PSS (EcoRI)5′-G AATTC-3′
3′-CTTAA G-5′
5′-GAATTC-3′
   • • • •
3′- CTTAAG-5′
5′-GAATTC-3′
3′-CTTAAG-5′
1 (8/8)1 (7/7)
5′-PSS non correspondant (NotI�oRI)5′-C AATTC-3′
3′-GCCGG G-5′
5′-C▸▸▸�T T C-3′
3′-GCCGG◂◂◂◂G-5′
5′-CGGCCAATTC-3′
3′-GCCGGTTAAG-5′
0.77 (10/13)0.92 (12/13)
5′-CGGCCAT TC-3′
3′-GCCCGGTAAG-5′
0.08 (1/13)0.08 (1/13)
5′-CGGCCT TC-3′
3′-GCCGGAAG-5′
0.15 (2/13)0 (0/13)
Bout émoussé + 5′-PSS (BamHI�oRV)5′-G ATC-3′
3′-CCTAG TAG-5′
5′-G▸▸▸𥮊TC-3′
3′-CC T A G T AG -5′
5′-GGATCATC-3′
3′-CCTAGTAG-5′
0.92 (11/12)0.92 (12/13)
5′-GGATATC-3′
3′-CCTATAG-5′
0.08 (1/12)0.08 (1/13)
Cohésif 3′-PSS (PstI)5′-CTGCA G-3′
3′-G ACGTC-5′
5′-CTGCAG-3′
   • • • •
3′-GACGTC-5′
5′-CTGCAG-3′
3′-GACGTC-5′
1 (8/8)1 (8/8)
3′-PSS non correspondant (SacI–KpnI)5′-TGGAGCT CCA-3′
3′-ACC CATGGGT-5′
5′-TGGAGCT CCA-3′
       •○○
3′-ACC CATGGGT-5′
5′-TGGAGTACCCA-3′
3′-ACCTCATGGGT-5′
0.75 (21/28)0.63 (17/27)
5′-TGGAGCTACAC-3′
3′-ACCTCGATGGT-5′
0.11 (3/28)0.26 (7/27)
5′-TGGAGCTCCCA-3′
3′-ACCTCGAGGGT-5′
0.03 (1/28)0 (0/27)
5′-TGGAGCTACCCA-3′
3′-ACCTCGATGGGT-5′
0.03 (1/28)0 (0/27)
5′-TGGAGCCCA-3′
3′-ACCTCGGGT-5′
0.03 (1/28)0.07 (2/27)
5′-TGTACCCA-3′
3′-ACATGGGT-5′
0 (0/28)0.04 (1/27)
5′-TGGATACCCA-3′
3′-ACCTATGGGT-5′
0.03 (1/28)0 (0/27)
3′-PSS non correspondant (PstI–KpnI)5′-CTGCA C-3′
3′-G CATGG-5′
5′ - CTGCA C-3′
     • ○ •
3′-G CATGG-5′
5′-CTGTACC-3′
3′-GACATGG-5′
0.64 (9/14)0.64 (9/14)
5′-CTGCACC-3′
3′-GACGTGG-5′
0.21 (3/14)0.28 (4/14)
5′-CTGCC-3′
3′-GACGG-5′
0.14 (2/14)0 (0/14)
5′-CTACC-3′
3′-GATGG-5′
0 (0/14)0.07 (1/14)
Blunt end + 3′-PSS (SacI–SmaI)5′-GAGCT GGGC-3′
3′-C CCCG-5′
5′-GAGCTGGGC-3′
3′-C◂◂◂�G-5′
5′-GAGCTGGGC-3′
3′-C TCGACCCG-5′
0.77 (10/13)0.71 (10/14)
5′-GAGCTAGGGC-3′
3′-C TCGATCCCG-5′
0.08 (1/13)0.07 (1/14)
5′-GAGCTTGGGC-3′
3′-CTCGAACCCG-5′
0 (0/13)0.14 (2/14)
5′-GAGCTTTGGGC-3′
3′-CTCGAAACCCG-5′
0 (0/13)0.07 (1/14)
5′-GAGCTATAGGGC-3′
3′-C TCGATATCCCG- 5′
0.08 (1/13)0 (0/13)
5′-GAAAGGGC-3′
3′-CT T TCCCG-5′
0.08 (1/13)0 (0/13)
5′-PSS + 3′-PSS (PstI–XhoI)5′-CTGCA TCGAG7C-3′
3′-G C7G-5′
5′-C T GC A T C G AG7C-3′
3′-G◂◂◂◂◂◂◂𥰬7G-5′
5′-CTGCATCGAG7C-3′
3′-GACGTAGCTC7G-5′
0.64 (9/14)0.71 (10/14)
5′-CTGCTCGAG7C-3′
3′-GACGAGCTC7G-5′
0.07 (1/14)0.07 (1/14)
5′-CTGCACGAG7C-3′
3′-GACGTGCTC7G-5′
0.07 (1/14)0 (0/14)
5′-CTGCAGAG7C-3′
3′-GACGTCTC7G-5′
0.07 (1/14)0 (0/14)
5′-CTGCGAG7C-3′
3′-GACGCTC7G-5′
0.07 (1/14)0 (0/14)
5′-CTG5C-3′
3′-GAC5G-5′
0 (0/14)0.07 (1/14)
5′-CTGCATTCGAG7C-3′
3′-GACGTAAGCTC7G-5′
0 (0/14)0.07 (1/14)
5′-CTGCAGTCGAG7C-3′
3′-GACGTCAGCTC7G-5′
0 (0/14)0.07 (1/14)
5′-CTGCAATCGTG7C-3′
3′-GACGTTAGCAC7G-5′
0.07 (1/14)0 (0/14)

○, mismatched base-pair •, matched base-pair ▸, fill in DNA synthesis.

Altogether, our data demonstrate that Mre11 is dispensable for all aspects of DSB repair by NHEJ: efficiency, kinetics, and fidelity. This is consistent with results in S. pombe, in which the loss of Rad32, les Mre11 homologue, or Rad50 does not impair either the efficiency or the fidelity of NHEJ (Manolis et al., 2001). In contrast, the MRX complex has been reported to be important for NHEJ-mediated repair of both chromosomal and plasmid DSBs in S. cerevisiae (Moore and Haber, 1996 Boulton and Jackson, 1998). However, the mechanism by which the MRX complex participates in NHEJ has not been described. The differential requirement for the MRN complex is not a result of the DNA template used because our study and the studies in S. pombe et S. cerevisiae all used a plasmid-based assay (Boulton and Jackson, 1998 Manolis et al., 2001).

Our results are consistent with the only study addressing the consequences of a complete loss of Mre11 in vertebrates that was performed with a conditional Mre11-null chicken DT40 cell line (Yamaguchi-Iwai et al., 1999). Yamaguchi-Iwai et al. (1999) reported a higher radiosensitivity of MRE11//KU70/ − cells compared with MRE11/ − cells. They also observed similar levels of radiosensitivity in MRE11/ − Mre11 + and MRE11/ − Mre11 − cells from G1 to early S phase, when DSBs are repaired mainly by Ku70-dependent NHEJ in this cell line. Cependant, MRE11/ − cells grew very poorly and displayed a high rate of apoptosis upon Mre11 repression. Therefore, end-joining ability in Mre11-deficient cells could not be assessed directly in this study.

In summary, our study establishes that Mre11 is not required for intramolecular end joining of linear DNA molecules or for the Ku70-independent intermolecular end joining of linear DNA in a vertebrate system.


Discussion

We have established a role for Wwox in the regulation of DSB repair, such that Wwox-deficient cells exhibit enhanced HDR and survival of DSB-inducing agents. We also reveal a novel interaction of Wwox protein with Brca1, the genome caretaker that mediates HDR repair of DSBs and hypothesize that Wwox suppresses HDR through its interaction with Brca1, tipping the pathway choice to NHEJ repair. Unlike a recently reported interaction between Wwox and the kinase, ATM, 16 the interaction of Wwox with Brca1 appears not to be dependent on DNA damage. Our co-immunoprecipitation experiments confirmed that Wwox may interact with Brca1 near the 981 PPLF 984 motif as Brca1 mutants lacking amino acids 305–1292 did not bind Wwox. Therefore, we propose that in Wwox-sufficient cells, Wwox binds Brca1, directly or indirectly, along this central region, competing with other Brca1-interacting proteins critical for promoting HDR. One candidate, Rad50, a component of the MRN complex, binds Brca1 at amino acids 341–758. 32 This interaction is responsible for stimulating nuclease activity of CtIP and MRN to enable end resection, which commits cells to HDR or SSA. We offer a model (Figure 7c) that proposes Wwox competes with Rad50 for binding to Brca1 and subsequently impairs end resection in Wwox-sufficient cells. In this way, Wwox deficiency, which commonly occurs in cancer cells, lacks an inhibitory regulatory step, resulting in enhanced end resection and HDR repair, ultimately enabling the cells to survive DNA damage-inducing cytotoxic treatments.

With this delineation of a role for Wwox in DNA repair pathway choice, we have established that Wwox is a genome caretaker, apparently paradoxically, through its role in supporting NHEJ repair, an imperfect pathway. If Wwox is involved in genome caretaking how can it be that the absence of Wwox pushes cells toward HDR, the presumptive pathway of choice for best repair, and in this case, the pathway to increased survival cellular survival of severe induced DNA damage? We believe that the enhancement of HDR because of Wwox absence is mutagenic in Wwox-deficient cells based on the cell cycle analysis data (Figure 4), which demonstrates that Wwox expression does not affect cell cycle phase. This implies that although HDR is enhanced, it is not restricted to S or G2 phases of the cell cycle in Wwox-deficient cells. If HDR should occur in the G1 phase, when sister chromatids are unavailable, the homology search may take place across the entire genome, increasing opportunities for mutagenesis because of inappropriate pairing. 33 In addition, we have shown that loss of Wwox significantly alters the efficiencies of the remaining DSB repair pathways (summarized in Figure 3f), impairing NHEJ and Alt-NHEJ, but enhancing SSA, a mutagenic repair pathway that typically generates large deletions with no insertions. 27 As the DSB repair pathways are complex and interconnected, it is difficult at this point to assign specifically the mutational burden or consequences of Wwox dysregulation to individual altered repair pathways following DNA damage. However, the chromosomal instability and large deletions observed through karyotype and CNV analysis associated with Wwox loss supports the idea that Wwox deficiency is mutagenic. As loss of Wwox has been well documented in association with the progression of numerous human cancers cancers, 1, 10 we propose that long-term, Wwox-deficient cells carry a higher mutational burden despite short-term cellular survival of DNA DSBs because of enhanced HDR.

Our findings have important, broad therapeutic implications as Wwox is among the most commonly deleted genes in a wide variety of common human cancers. 1, 8, 9, 34 We propose that determining Wwox expression levels could be an important predictor of response to radiation, cisplatin and possibly other chemotherapeutic agents. Stratifying cancers by Wwox expression could allow physicians to determine whether particular cancers would be good candidates for radiation and perhaps also inform the dosage of DSB-inducing treatments. Most importantly, we show that selectively inhibiting the HDR pathway in Wwox-deficient cells abolishes their radioresistance and resensitizes them to radiation, suggesting the use of HDR inhibitors in conjunction with radiation for treatment of Wwox-deficient tumors.


Introduction

Mammalian cells rely on the nonhomologous end-joining (NHEJ) pathway to repair most of their DNA double-strand breaks (DSBs), the most harmful type of DNA damage (Khanna and Jackson, 2001). NHEJ is a mechanism in which broken ends at a DSB site are rejoined without requiring extended segments of homology. The main components of the vertebrate NHEJ machinery comprise DNA ligase IV, XRCC4, Artemis, and the DNA-dependent protein kinase (DNA-PK), which is composed of a large catalytic subunit, DNA-PKcs, and the Ku70/80 heterodimer. Defects in NHEJ factors result in radiosensitivity and immunodeficiency syndromes, as vertebrate lymphocytes rely on the NHEJ pathway to complete the rejoining step of V(D)J recombination (Taccioli et al., 1993 Nussenzweig et al., 1996).

The MRN/MRX complex is a multisubunit nuclease that is composed of Mre11, Rad50, and Nbs1 (Xrs2 in Saccharomyces cerevisiae). Mutations in genes encoding these proteins result in genomic instability, increased sensitivity to ionizing radiation, telomere shortening, and meiosis defects (D'Amours and Jackson, 2002). Dans S. cerevisiae, HO-induced NHEJ-dependent cell survival is reduced in mre11, rad50, ou xrs2 mutants (Moore and Haber, 1996). Mutations in any of the MRN/X complex components display a 40–50-fold reduction in the efficiency of plasmid end joining in S. cerevisiae (Boulton and Jackson, 1998) but show no significant defects in Schizosaccharomyces pombe (Manolis et al., 2001).

Mre11, Rad50, et Nbs1 are all essential genes in vertebrates (Xiao and Weaver, 1997 Luo et al., 1999 Zhu et al., 2001). In vitro studies with extracts from mammalian cells indicated a requirement for the MRN complex in the NHEJ pathway (Huang and Dynan, 2002 Zhong et al., 2002). In contrast, no DSB repair deficiency has been observed in human or mouse cells harboring hypomorphic mutations in the Mre11 ou Nbs1 gene, which are responsible for Ataxia telangiectasia–like disorder (ATLD) or Nijmegen breakage syndrome, respectively (Varon et al., 1998 Stewart et al., 1999). However, a subset of MRN complex activities is still associated with ATLD and Nijmegen breakage syndrome alleles (Stewart et al., 1999 Theunissen et al., 2003 Costanzo et al., 2004). Therefore, these experiments could not rule out a role for the MRN complex in NHEJ.

Xenopus laevis egg extracts support highly efficient and precise end joining of linear DNA molecules using similar pathways to those found in mammalian cells (Pfeiffer and Vielmetter, 1988 Thode et al., 1990 Sandoval and Labhart, 2002). These extracts have been used extensively to characterize the role of the Ku protein in eukaryotic NHEJ (Labhart, 1999 Sandoval and Labhart, 2002). In this study, we show that in contrast to Ku70-depleted extracts, Mre11-depleted extracts are competent to end join with high efficiency regardless of the DNA end structure. We find that the kinetics of end joining as well as the sequence of junctions formed is comparable in the absence of Mre11 and in mock-depleted extracts. Together, our data indicate that the MRN complex plays no detectable role in the repair of DSBs by the NHEJ pathway.


Polθ: new focus

DNA polymerase theta (Polθ, also known as PolQ, encoded by POLQ) is a unique A-family DNA polymerase. It contains a helicase-like domain at its N terminus, which is separated from the C-terminal polymerase domain by a long, unstructured central region (Fig. 3). The helicase-like domain of Polθ is conserved among higher organisms. It shares more than 50% sequence similarity with human HELQ (also known as HEL308), which possesses dsDNA unwinding activity in vitro. However, up to now, no any strand replacement activity was identified in the helicase-like domain of Polθ either in vivo or in vitro although it showed high level of ssDNA-dependent ATPase activity [41]. The C-terminal polymerase domain of Polθ exhibits highly promiscuous enzyme activity. It exhibits low-fidelity DNA synthesis, translesion synthesis and lyase activity. Polθ also can promote extension of ssDNA and partial ssDNA substrates in an error-prone manner [42–45]. Since it was identified as the product of the POLQ gene more than 25 years ago, Polθ has been reported to get involved in distinct DNA damage repair pathways in different organisms. However, how its enzymatic activity link to its cellular functions still not well understood [46–50]. Recently, several reports emphasized a central role of Polθ in MMEJ-mediated DSB repair in higher organisms. Les premières études en Drosophile indicated that Polθ promotes I-sceI-induced MMEJ, whereas polq-1 was shown to be required for MMEJ in response to replication-fork collapse at G quadruplexes in C. elegans [51, 52]. Recent studies in mice indicated that Polθ is associated with MMEJ-mediated fusions of dysfunctional telomeres and chromosomal translocation. Polθ was recruited to DNA damage sites induced by laser micro-irradiation in a PARP-1 dependent manner and promoted MMEJ in endonuclease-mediated reporter system [15]. Biochemical study revealed that purified human Polθ protein possesses unique MMEJ promotion activity [53]. Polθ promotes DNA synapse formation, microhomology annealing and the following synapse stabilization by catalyzing overhang extension, then stimulating MMEJ of DNA substrate containing 3′ ssDNA overhang with more than 2 bp of homology [53] The conserved insertion loop2 domain (L2 domain, Fig. 3) is important for MMEJ activity of Polθ both in vitro and in vivo. L2 domain may promote oligomerization of Polθ protein, then driving DNA end synapsis and MMEJ [53]. There are no reports to show whether the helicase-like and central domain of Polθ also directly joined in the MMEJ. However, Ceccaldi et al. identified a Rad51 binding motif in the central part of Polθ and demonstrated that ATPase activity and Rad51 binding capacity may help Polθ to block RAD51 nucleofilament assembly and HR activity, thus channelling DSB repair to MMEJ pathway. This suggests that indirect regulatory function of Polθ may also contribute to MMEJ activity.

Domain structures of Polθ and its distinct functions. Polθ contain a N-terminal helicase like domain, a long central domian and a C-terminal polymerase domain. Polymerase domain mediates MMEJ. ATPase activity of helicase like domain and Rad51 binding motif in the central domain contribute to HR suppression


Harvard

T1 - Ovarian Cancers Harbour Defects in Non-Homologous End Joining Resulting in Resistance to Rucaparib

AU - O'Donnell, Rachel Louise

N1 - Copyright 2016, American Association for Cancer Research.

N2 - PURPOSE: DNA damage defects are common in ovarian cancer and can be used to stratify treatment. Although most work has focussed on Homologous Recombination (HR), DNA double strand breaks are repaired primarily by non-homologous end joining (NHEJ). Defects in NHEJ have been shown to contribute to genomic instability and have been associated with the development of chemoresistance.EXPERIMENTAL DESIGN: NHEJ was assessed in a panel of ovarian cancer cell lines and 47 primary ascitic derived ovarian cancer cultures, by measuring the ability of cell extracts to end-join linearized plasmid monomers into multimers. mRNA and protein expression of components of NHEJ was determined using RT-qPCR and western blotting. Cytotoxicities of cisplatin and the Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP) inhibitor rucaparib were assessed using sulforhodamine B (SRB) assays. HR function was assessed using γH2AX/RAD51 foci assay.RESULTS: NHEJ was defective (D) in 4 of 6 cell lines and 20 of 47 primary cultures. NHEJ function was independent of homologous recombination (HR) competence (C). NHEJD cultures were resistant to rucaparib (p=0.0022). When HR and NHEJ functions were taken into account, only NHEJC/HRD cultures were sensitive to rucaparib (compared to NHEJC/HRC p=0.034, NHEJD/HRC p=0.0002, and NHEJD/HRD p=0.0045). The DNA-PK inhibitor, NU7441 induced resistance to rucaparib (p=0.014) and HR function recovery in a BRCA1 defective cell line.CONCLUSION: This study has shown that NHEJ is defective in 40% of ovarian cancers, which is independent of HR function and associated with resistance to PARP inhibitors in ex vivo primary cultures.

AB - PURPOSE: DNA damage defects are common in ovarian cancer and can be used to stratify treatment. Although most work has focussed on Homologous Recombination (HR), DNA double strand breaks are repaired primarily by non-homologous end joining (NHEJ). Defects in NHEJ have been shown to contribute to genomic instability and have been associated with the development of chemoresistance.EXPERIMENTAL DESIGN: NHEJ was assessed in a panel of ovarian cancer cell lines and 47 primary ascitic derived ovarian cancer cultures, by measuring the ability of cell extracts to end-join linearized plasmid monomers into multimers. mRNA and protein expression of components of NHEJ was determined using RT-qPCR and western blotting. Cytotoxicities of cisplatin and the Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP) inhibitor rucaparib were assessed using sulforhodamine B (SRB) assays. HR function was assessed using γH2AX/RAD51 foci assay.RESULTS: NHEJ was defective (D) in 4 of 6 cell lines and 20 of 47 primary cultures. NHEJ function was independent of homologous recombination (HR) competence (C). NHEJD cultures were resistant to rucaparib (p=0.0022). When HR and NHEJ functions were taken into account, only NHEJC/HRD cultures were sensitive to rucaparib (compared to NHEJC/HRC p=0.034, NHEJD/HRC p=0.0002, and NHEJD/HRD p=0.0045). The DNA-PK inhibitor, NU7441 induced resistance to rucaparib (p=0.014) and HR function recovery in a BRCA1 defective cell line.CONCLUSION: This study has shown that NHEJ is defective in 40% of ovarian cancers, which is independent of HR function and associated with resistance to PARP inhibitors in ex vivo primary cultures.

JO - Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research

JF - Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research


Introduction

Double-strand breaks (DSB ref. 1), the most lethal forms of DNA damage, are repaired by 2 main pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). These pathways are distinct in that HR copies identical DNA sequences from sister chromatids resulting in error-free repair (2), whereas NHEJ joins the broken DNA ends with limited processing (3). In vitro studies have demonstrated that complementary DNA ends are joined in an efficient and accurate manner by NHEJ (4, 5). However, the modification required for partially or completely incompatible DNA ends results in losses of sequence at the resultant junctions, such that NHEJ is potentially a mutagenic process (3, 6). More recent studies have demonstrated an alternative end joining mechanism (A-EJ), which uses regions of microhomology at internal sites on the DNA substrate. Unlike HR, A-EJ is inherently error-prone, as the use of microhomology leads to deletions of sequences from the strand being repaired and to chromosomal translocations (7, 8). This mechanism has been suggested to function in the absence of NHEJ (9–14) and more recently in absence of HR (7, 8).

NHEJ has been demonstrated to function throughout the cell cycle (1, 15). The NHEJ pathway is initiated by the binding of the Ku heterodimer (Ku70 and Ku80) to DSBs, and the subsequent association and autophosphorylation of the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs ref. 16). This DNA-PK complex facilitates ligation by recruitment of the XRCC4/LIG4 complex. Mutations in NHEJ components are associated with immunodeficiency and developmental abnormalities (17, 18) as well as cancers (6, 19–22), underscoring the importance of the NHEJ pathway in maintaining genome integrity.

DNA damage repair (DDR) is increasingly recognized as an important determinant of response to cancer therapeutics. This interest was initially provoked by the paradigm shifting discovery that inhibition of base excision repair with PARP1 inhibitors (PARPi) was synthetically lethal in HR-defective (HRD) tumors. PARPi were therefore selectively targeting the defect arising in the tumors, but not in normal tissues (23–27). In epithelial ovarian cancer (EOC), HRD is reported in 50% of cases (28) and evidence is building for the efficacy of PARPi. This has been assumed to be as a result of synthetic lethality, with PARPi preventing effective base excision repair leading to stalled replication forks which in turn could not be repaired by HR. However, a number of studies also indicate a connection between components of the NHEJ pathway and PARP1 (29–35), culminating in the suggestion by Patel and colleagues that dysfunctional NHEJ is important in generating genomic instability in PARPi-treated, HRD cells (36). Moreover, they also demonstrated that inhibition of DNA-PK results in HR function recovery and PARPi resistance in vitro (37).

The suggestion that NHEJ status is important in determining sensitivity to PARP inhibitors is in keeping with evidence that NHEJ is a fast pathway which is the pathway of choice for the repair of DSBs with HR only being employed for unrepaired DSBs (38).

The incidence of NHEJ dysfunction has not been explored in primary EOC to date. Here we demonstrate that more than 40% of primary ovarian cancer (PCO) cultures are NHEJ-defective (NHEJD), which is associated with resistance to rucaparib ex vivo.


Construction of a series of episomal plasmids and their application in the development of an efficient CRISPR/Cas9 system in Pichia pastoris

The methylotrophic yeast Pichia pastoris is widely used in recombinant expression of eukaryotic proteins owing to the ability of post-translational modification, tightly regulated promoters, and high cell density fermentation. However, episomal plasmids for heterologous gene expression and the CRISPR/Cas9 system for genome editing have not been well developed in P. pastoris. In the present study, a panel of episomal plasmids containing various autonomously replicating sequences (ARSs) were constructed and their performance in transformation efficiency, copy numbers, and propagation stability were systematically compared. Among the five ARSs with different origins, panARS isolated from Kluyveromyces lactis was determined to have the best performance and used to develop an efficient CRISPR/Cas9 based genome editing system. Compared with a previously reported system using the endogenous and most commonly used ARS (PARS1), the CRISPR/Cas9 genome editing efficiency was increased for more than tenfold. Owing to the higher plasmid stability with panARS, efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing with a type III promoter (i.e. SER promoter) to drive the expression of the single guide RNA (sgRNA) was achieved for the first time. The constructed episomal plasmids and developed CRISPR/Cas9 system will be important synthetic biology tools for both fundamental studies and industrial applications of P. pastoris.

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Voir la vidéo: Double stranded break repair - Non homologous end joining explained. (Janvier 2022).