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Comment fonctionne l'enzyme Dicer dans le complexe RISC ?


Je sais que le RISC (complexe de silençage induit par l'ARN) est l'un des principaux complexes impliqués dans la régulation des gènes par l'ARNi. Ce que je veux savoir, c'est quel rôle exactement Dicer joue-t-il dans ce complexe ?


Dicer est une endo-ribonucléase appartenant à la classe RNAse-III. Dicer ne fait pas partie du RISC. Il aide cependant à la formation de RISC en clivant l'ARNdb ou la tige d'ARN en épingle à cheveux aux deux extrémités, ce qui libère un petit produit d'ARNdb. Ensuite, l'un des brins est chargé dans le RISC.

Il y a plusieurs critiques sur ce sujet et il y a aussi une vidéo que vous pouvez trouver sur youtube.


Frontières en biosciences moléculaires

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    Les scientifiques de Berkeley obtiennent un premier aperçu détaillé de Dicer

    BERKELEY, CA – Les scientifiques ont eu leur premier aperçu détaillé de la structure moléculaire d'une enzyme que la nature utilise depuis des éons pour aider à faire taire les messages génétiques indésirables. Une équipe de chercheurs du Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) et de l'Université de Californie à Berkeley a utilisé la cristallographie aux rayons X au Berkeley Lab&rsquos Advanced Light Source (ALS) pour déterminer la structure cristalline de Dicer, une enzyme qui joue un rôle essentiel dans le processus connu sous le nom d'interférence ARN. L'enzyme Dicer est capable de découper une forme d'ARN double brin en segments qui peuvent s'attacher aux gènes et bloquer leur activité.

    Jennifer Doudna est une biochimiste qui détient des nominations conjointes avec Berkeley Lab, UC Berkeley et HHMI. Elle est une autorité de premier plan sur les structures moléculaires de l'ARN.

    "Avec cette structure cristalline, nous avons appris que Dicer sert de règle moléculaire, avec une pince à une extrémité et un couperet à l'autre extrémité à une distance définie, qui produit des fragments d'ARN d'une taille idéale pour le silençage génique", a déclaré Jennifer Doudna. , un biochimiste qui a dirigé cette étude. Doudna, une autorité de premier plan sur les structures moléculaires de l'ARN, occupe des postes conjoints avec la division des biosciences physiques du laboratoire Berkeley, le département de biologie moléculaire et cellulaire et le département de chimie de l'UC Berkeley. Elle est également chercheuse au Howard Hughes Medical Institute (HHMI).

    "Connaître la structure de Dicer ouvre la voie à la compréhension de la manière dont les enzymes Dicer sont impliquées dans d'autres phases de la voie d'interférence ARN", a déclaré Doudna. &ldquoDans les cellules humaines, les preuves indiquent que Dicer fait partie d'un complexe moléculaire plus large qui dirige le processus d'interférence ARN. La structure centrale de Dicer a été hautement conservée par l'évolution et pourrait servir de guide pour reconcevoir les molécules d'ARN qui dirigent des voies spécifiques de silençage génique.

    L'interférence ARN est un ancien processus de silençage génique qui joue un rôle fondamental dans un certain nombre de fonctions importantes, notamment la défense virale, le remodelage de la chromatine, le réarrangement du génome, la synchronisation du développement, la morphogenèse du cerveau et la maintenance des cellules souches. Toutes ces activités d'interférence ARN dépendent de Dicer, donc comprendre la structure moléculaire de cette enzyme est une étape critique.

    Les résultats de cette recherche sont publiés dans l'édition du 13 janvier 2006 de la revue Science dans un article intitulé : Base structurelle pour double brin Traitement de l'ARN par Dicer. Ian MacRae, Kaihong Zhou, Fei Li, Adrian Repic, Angela Brooks, Zacheus Cande et Paul Adams ont co-écrit l'article avec Doudna.

    L'ARN & mdash acide ribonucléique & mdash est connu depuis longtemps comme un cheval de bataille biologique polyvalent, responsable de la transmission des messages génétiques de l'ADN à partir du noyau d'une cellule vivante et de l'utilisation de ces messages pour fabriquer des protéines spécifiques dans le cytoplasme d'une cellule. En 1998, cependant, les scientifiques ont découvert que l'ARN peut également bloquer la synthèse de protéines à partir de certains de ces messages génétiques. Ce processus de silençage génique est appelé interférence ARN et il commence lorsqu'un segment double brin d'ARN rencontre l'enzyme Dicer. L'ARN double brin (ARNdb) est formé de deux brins simples d'ARN avec des séquences de bases complémentaires.

    Dicer clive l'ARNdb en fragments plus petits appelés ARN interférents courts (siARN) et microARN (miARN). Dicer aide ensuite à charger ces fragments de siARN et de miARN dans un grand complexe multiprotéique appelé RISC, pour RNA-Induced Silencing Complex. RISC peut rechercher et capturer des molécules d'ARN messager (ARNm) (l'ARN qui code le message d'un gène) avec une séquence de bases complémentaire à celle de son siARN ou miARN. Celui-ci sert soit à détruire purement et simplement le message génétique porté par l'ARNm, soit à bloquer la synthèse ultérieure d'une protéine.

    Jusqu'à présent, on ne savait pas comment Dicer est capable de reconnaître l'ARNdb et de cliver ces molécules en produits avec des longueurs qui sont exactement ce qui est nécessaire pour faire taire des gènes spécifiques. Doudna et ses co-auteurs ont pu purifier et cristalliser une enzyme Dicer à partir de Giardia intestinalis, un parasite microscopique unicellulaire qui peut infecter les intestins des humains et des animaux. Cette enzyme Dicer dans Giardia est identique au noyau d'une enzyme Dicer chez les eucaryotes supérieurs, y compris les humains, qui clive l'ARNdb en longueurs d'environ 25 bases.

    Une vue de face d'une représentation en ruban de Dicer montre que l'enzyme ressemble à une hache avec la pince à ARN au niveau du manche (le domaine PAZ) et le couperet au niveau de la lame (RNase IIIa et IIIb). Une zone de connecteur plat mesurant 65 angströms est la partie de règle qui est utilisée pour mesurer des segments de 25 nucléotides (bases) de longueur. Un segment d'ARN double brin (bleu) est montré en passant par l'enzyme Dicer.

    Dans leurs Science papier, Doudna et ses collègues décrivent une vue de face de la structure comme ressemblant à une hache. À l'extrémité de la poignée, il y a un domaine qui est connu pour se lier à de petits produits d'ARN, et à l'extrémité de la lame, il y a un domaine qui est capable de cliver l'ARN. Entre la pince et le couperet se trouve une région à surface plane qui porte une charge électrique positive. Doudna et ses collègues proposent que cette région plate se lie à l'ARNdb chargé négativement comme le Velcro biologique, permettant à Dicer de mesurer et de couper des longueurs spécifiées d'ARNsi.

    &ldquoLorsque vous assemblez la pince, la zone plate et le couperet, vous obtenez une assez bonne idée du fonctionnement de Dicer,&rdquo Doudna. &ldquoNous&rsquo utilisons maintenant ce modèle structurel pour concevoir des expériences qui pourraient nous dire ce qui déclenche l'action de Dicer.&rdquo

    Différentes formes de l'enzyme Dicer sont connues pour produire différentes longueurs d'ARNsi. Après avoir identifié la région à surface plane chargée positivement dans Dicer comme la partie & ldquoruler & rdquo de l'enzyme, il peut être possible de modifier la longueur d'une longue hélice de connecteur dans ce domaine pour modifier les longueurs des produits siRNA résultants.

    &ldquoUne taille unique ne convient pas à tous pour Dicer, elle fabrique des produits ARNdb dont la longueur varie de 21 à 30 paires de bases ou plus. Nous aimerions voir ce qui se passe lorsque vous prenez un Dicer naturel et modifiez la longueur de son hélice », a déclaré Doudna.

    La détermination de la structure cristalline de Dicer a été rendue possible grâce aux capacités de cristallographie uniques d'ALS Beamline 8.2.1 et 8.2.2, a déclaré Doudna. Financées par HHMI, les lignes de lumière 8.2.1 et 8.2.2 sont alimentées par un aimant de courbure supraconducteur, une source idéale de rayons X pour les expériences de cristallographie des protéines. L'aimant &ldquosuperbend&rdquo est utilisé pour extraire les rayons X d'un faisceau relativiste d'électrons circulant à travers l'anneau de stockage ALS à des énergies allant jusqu'à deux milliards d'électrons-volts.

    Les faisceaux de rayons X de l'ALS sont généralement cent millions de fois plus brillants que ceux des meilleurs tubes à rayons X. Lorsqu'un faisceau de rayons X est envoyé à travers un cristal, les atomes du cristal provoquent la diffusion des rayons X, créant un motif de diffraction. Ce diagramme de diffraction peut être traduit par ordinateur en images 3-D du cristal.

    Les travaux rapportés dans le Science L'article de Doudna et ses collègues a été financé par le programme des sciences de l'énergie de base du ministère de l'Énergie et les National Institutes of Health.


    Discussion

    Nos résultats indiquent que Loqs et Dicer-1 forment un complexe qui convertit les pré-miARN en miARN matures. Comment agissent-ils ensemble dans le traitement des pré-miARN ? La comparaison des séquences révèle que Loqs est un paralogue de R2D2 (voir Figure 1). Par conséquent, Loqs peut jouer le rôle moléculaire de R2D2 pour Dicer-1. R2D2 forme un complexe hétérodimérique stable avec Dicer-2, tandis que l'une ou l'autre protéine seule semble être instable in vivo [59]. En l'absence de R2D2, Dicer-2 est toujours capable de transformer efficacement de longs ARNdb en siARN. Par conséquent, l'activité de génération d'ARNsi de Dicer-2 ne dépend pas de R2D2. Cependant, les siARN résultants ne sont pas efficacement canalisés dans RISC en l'absence de R2D2. Le complexe Dicer-2-R2D2, mais pas Dicer-2 seul, se lie au siRNA, ce qui indique que la liaison du siRNA par l'hétérodimère est importante pour l'entrée dans RISC [59,66]. Dans le cas de Loqs, cette protéine seule n'est pas capable de convertir les pré-miARN en miARN matures, mais elle stimule et dirige clairement l'activité spécifique de traitement des pré-miARN de Dicer-1. De plus, la suppression de Loqs a nettement réduit l'activité de traitement pré-miARN dans les lysats cytoplasmiques in vitro (voir les figures 4C et 5B), mais n'a pas entraîné de réduction significative du niveau de protéine Dicer-1 (voir la figure 2B), ce qui implique que Dicer- 1 peut largement dépendre de Loqs pour son activité de traitement pré-miARN. Ainsi, le rôle moléculaire de Loqs pour Dicer-1 n'est pas simplement similaire à celui de R2D2 pour Dicer-2.

    Il peut être envisagé que Loqs puisse avoir l'un des nombreux rôles dans le traitement des pré-miARN. Dicer-1 ne contient qu'un seul dsRBD, ce qui peut ne pas être suffisant pour une interaction forte avec et/ou une reconnaissance spécifique du substrat pré-miARN (voir Figure 6C et 6D). Les Loqs, contenant trois dsRBD sans aucun autre domaine identifiable apparent, pourraient fournir les modules de liaison à l'ARN supplémentaires requis pour la reconnaissance spécifique du pré-miARN, et ainsi stabiliser la liaison du pré-miARN pour Dicer-1. Les Loqs pourraient également organiser la liaison de Dicer-1 sur le pré-miARN, contribuant au positionnement spécifique du site de clivage de Dicer-1. Alternativement, étant donné que les dsRBD sont connus non seulement pour se lier aux ARNdb mais également pour médier les interactions protéine-protéine [67], les Loqs peuvent se lier directement à Dicer-1 via ses dsRBD. Cette interaction protéine-protéine peut déclencher un changement de conformation de Dicer-1 qui facilite soit la formation d'un dimère intramoléculaire de ses deux domaines RNase III [50,68], qui crée une paire de sites catalytiques, soit le transfert du Dicer- 1 a clivé les miARN matures au RISC.

    L'analyse des séquences a révélé que l'activateur protéique de la protéine kinase ARNdb dépendante (PKR) (PACT) [69] et la protéine de liaison à l'ARN TAR du VIH (TRBP) [70] chez les mammifères présentent une identité de 34 % avec Loqs et partagent une structure de domaine très similaire avec elle. (Figure 8). On pense que PACT et TRBP jouent un rôle dans la régulation de la traduction en modulant la PKR qui contient également deux dsRBD [71-73]. PACT interagit avec la PKR et améliore l'autophosphorylation de la PKR [67], qui à son tour phosphoryle la sous-unité α du facteur d'initiation de la traduction eucaryote 2 (eIF2α) et conduit à une inhibition de la traduction de l'ARNm en réponse à une infection virale et à d'autres stimuli. TRBP empêche l'inhibition de la synthèse des protéines par la PKR en se liant à la PKR [74]. Considérés ensemble, il sera important de trouver des partenaires de Loqs autres que Dicer-1 pour une éventuelle implication de Loqs dans la régulation traductionnelle médiée par les miARN dans Drosophile.

    Le motif de liaison à l'ARNdb (dsRBD) est indiqué par une boîte noire. Ces protéines contiennent trois dsRBD putatifs. Loqs partage ∼34% d'identité d'acides aminés avec TRBP et PACT et ∼31% d'identité avec Xlrbpa (Xénope laevis protéine de liaison à l'ARN A). Comparaison de séquences entre Loqs et son humain et Xénope les homologues ont également montré un degré plus élevé de conservation des acides aminés dans les dsRBD, y compris les dsRBD non canoniques C-terminaux. LesXénope l'homologue Xlrbpa de TRBP/PACT s'est associé aux ribosomes dans le cytoplasme [77], comme c'est le cas pour de nombreux facteurs ARNi, y compris les miARN [47,78-82].


    Comment fonctionne l'enzyme Dicer dans le complexe RISC ? - La biologie

    Créé par Alexandra Asaro

    La protéine Dicer est un composant de traitement clé dans la biogenèse des petits ARN interférents (siARN), y compris les microARN (miARN). La fonction essentielle de Dicer est de reconnaître, de lier et de cliver des segments plus longs d'ARN double brin (ARNdb) en duplex d'ARNdb longs d'environ 25 paires de bases. (1) Les interactions protéine-ARN sous-tendent la fonction d'hydrolyse de l'ARN de Dicer. Dans l'ensemble, Dicer fonctionne pour convertir l'ARNdb tige-boucle en précurseurs duplex d'ARN de siARN et de miARN. Le produit Dicer RNA duplex présente un surplomb 3' de deux nucléotides, caractéristique du clivage de l'ARNaseIII. Une fois clivés par Dicer, les duplex de 25 pb sont séparés et l'un des brins d'ARN est incorporé dans le RNA Induced Silencing Complex (RISC). Le petit brin d'ARN facilite l'interférence ARN, la régulation négative de l'expression génique au niveau de l'ARN, en guidant le RISC vers une cible d'ARNm appropriée et en se liant à une région spécifique de l'ARNm, induisant ainsi une inhibition de la traduction et/ou une dégradation de l'ARNm. (1) La structure de Dicer a été initialement élucidée chez Giardia intestinalis.

    Les fonctions de Giardia Dicer comprennent la reconnaissance et la liaison d'un substrat d'ARN avec une structure secondaire tige-boucle et un surplomb 3' de deux nucléotides. Dicer doit lier cet ARN tige-boucle d'une manière spécifique le long de ses divers domaines afin que l'ARN soit correctement positionné pour le clivage. Le clivage de l'ARN en un duplex d'ARNdb plus petit implique des résidus conservés, la formation d'homodimères entre les domaines catalytiques et la coordination des cations. Des études impliquant la RNase bactérienne et des enzymes Dicer plus complexes, telles que la souris et la Dicer humaine, peuvent aider à élucider la structure des domaines que Giardia Dicer partage avec ces enzymes apparentées. Giardia Dicer contient un domaine PAZ, qui fonctionne dans la reconnaissance et la liaison spécifiques de l'ARNdb, et deux domaines de ribonucléase III (RNase III) qui effectuent le clivage du substrat dsARNd. (1) Les domaines PAZ et RNase sont reliés par une hélice de connexion de 65 angströms de long. Sa longueur correspond à la longueur du produit d'ARNdb de 25 nucléotides. (1) Un domaine N-terminal, le domaine de plate-forme, qui se compose de trois hélices alpha et d'une feuille plissée bêta, sous-tend le segment connecteur hélicoïdal alpha. Les deux domaines RNase III sont connectés via un domaine en hélice multi-alpha appelé domaine de pontage. (1) Dans l'ensemble, Dicer contient une hélice alpha, une feuille plissée bêta, des spires et une structure secondaire à bobine aléatoire.

    Le domaine PAZ, qui comprend une hélice alpha et une feuille bêta, reconnaît et se lie à des ARNdb spécifiques avec un surplomb 3' de 2 nucléotides. Le surplomb 3' reconnu est lié par un site de liaison dans le domaine PAZ. Pour accomplir la liaison, les résidus dans le domaine de liaison PAZ de Dicer forment des liaisons hydrogène avec les groupes hydroxyle de l'ARN. (1) Études de Zhang et. Al. ont confirmé que le domaine PAZ de dicer se lie préférentiellement aux substrats d'ARNdb avec deux surplombs 3' de nucléotide. (2) L'extrémité du duplex d'ARN liée au domaine PAZ contient l'extrémité 3' d'un brin du duplex, qui se lie à la poche de liaison en surplomb 3' du domaine PAZ (surlignée en jaune), et l'extrémité 5' du autre brin, qui se lie à la région de boucle riche en résidus ab asiques dans le domaine PAZ. Ces résidus basiques peuvent servir à stabiliser l'interaction de liaison au niveau de la poche de liaison en surplomb 3' en dessous. (1) Avec une extrémité du substrat d'ARNdb liée au domaine PAZ, l'autre extrémité du duplex d'ARN est positionnée entre les domaines RNase IIIa et RNase IIIb, qui contiennent des segments de structure alpha hélicoïdale.

    Le positionnement du duplex d'ARN nécessite une flexibilité conformationnelle dans Dicer. Lors de la liaison de l'ARNdb, un changement de conformation de la protéine permet une flexion et un positionnement appropriés du substrat dans la région catalytique. (3) Le domaine PAZ se déplace considérablement lors de la liaison à l'ARN. Ce déplacement est facilité par un résidu de proline dans l'hélice du connecteur, la proline-266, qui fonctionne comme une charnière et crée un pli dans l'hélice. Les domaines RNase subissent également un déplacement. L'interface des domaines de la plate-forme et de la RNase contient une autre région charnière qui contribue au mouvement conformationnel. (3) Giardia Dicer est capable de lier une variété de molécules d'ARNdb, même celles avec un appariement de bases imparfait. Étant donné que les paires de bases incompatibles dans l'ARNdb peuvent induire des boucles et des renflements de structure secondaire variables, la flexibilité conformationnelle de Dicer est essentielle pour sa liaison de diverses molécules d'ARNdb. (3) Un autre élément clé dans l'alignement du substrat est la boucle de positionnement située dans le domaine RNase IIIa, qui aide à positionner correctement le duplex d'ARN au site catalytique. La boucle se trouve en dessous de l'interface catalytique des deux sous-unités RNase où l'ARNdb se lie. Des études sur des mutants de boucle de positionnement Dicer ont montré que la boucle de positionnement était nécessaire pour donner le produit de 25 nucléotides souhaité après clivage, contrairement à la précision observée dans Dicer normal, les mutants généraient des produits d'ARN de taille aberrante. (4)

    Chacun des domaines RNase III contient quatre ou cinq résidus acides aminés conservés . Dans la RNase IIIa, les résidus sont E407, D340, D404 et E336 et dans la RNase IIIb, les résidus sont E684, E723, D653, D720 et E649. (1) Ces résidus aspartate et glutamate chargés négativement facilitent la liaison de deux cations métalliques par domaine RNase. Les chaînes latérales des résidus participent à la liaison hydrogène et forment une poche dans laquelle se produisent des interactions ioniques entre les cations métalliques et les chaînes latérales chargées négativement. Les cations métalliques, généralement Mg2+ (bien que Mn2+ montré ici) sont catalytiquement requis pour que les domaines de la RNase III effectuent le clivage des liaisons phosphodiester dans les deux brins du substrat de l'hélice d'ARN. (1) Les paires d'ions métalliques des deux domaines RNase III sont séparées par une distance, 17,5 angströms, égale à la largeur du substrat d'ARNdb. (1)

    Des études sur la RNase III bactérienne ont aidé à élucider le mécanisme de clivage de la RNase. Les cations sont nécessaires non seulement pour le clivage mais pour la liaison correcte du substrat d'ARN dans la région de la RNase. (1) Les deux sous-unités RNase forment une vallée catalytique et l'ARN doit être positionné dans cette vallée pour que le clivage se produise. Les cations empêchent la répulsion de charge entre les résidus négatifs dans la vallée catalytique et les phosphates négatifs tapissant le squelette de l'ARNdb, permettant ainsi au duplex d'ARN substrat de se lier de manière stable dans la vallée. (5) Sans les quatre cations Mg2+ liés, le substrat d'ARN peut se lier, mais ne peut pas se lier dans la vallée catalytique et par la suite ne peut pas être clivé. (5) La vallée catalytique est créée par dimérisation des deux domaines de la RNase III. La formation d'homodimères dans cette région est requise pour l'activité catalytique de Dicer. (4) Les liaisons hydrogène assurent la médiation de la liaison du substrat d'ARN le long des différents domaines de Dicer. La liaison hydrogène se produit entre les acides aminés et les résidus nucléotidiques dans la région catalytique de la RNase. (5) Le mécanisme de clivage de la liaison scissile est une réaction de transfert de groupe phosphoryle. Il nécessite deux cations Mg2+ pour le clivage au sein de chaque brin d'ARN. Pour cliver une liaison scissile, le premier cation Mg2+ abaisse le pKa d'une molécule d'eau, lui permettant de perdre un proton et de devenir un -OH. Ce -OH agit comme un nucléophile pour attaquer l'atome de phosphore lié au nucléotide qui sera clivé. Un intermédiaire pentacovalent autour de l'atome de phosphore se forme lors de cette attaque nucléophile. Le second Mg2+ interagit avec le groupe partant et facilite l'effondrement de cet intermédiaire en neutralisant la charge négative de l'atome d'oxygène. L'intermédiaire s'effondre avec la rupture d'une liaison phosphore-oxygène pour obtenir le clivage du brin d'ARN. (5) Le mécanisme révèle l'importance des cations Mg2+ pour la catalyse. Deux des cations sont nécessaires pour cliver un brin de l'ARN, donc pour cliver le substrat d'ARN duplex, quatre cations au total doivent être liés.

    Giardia Dicer partage une similarité structurelle avec le domaine nucléasique de la ribonuclase III de Mycobacterium Tuberculosis. Comme Giardia, le domaine endoribonucléase de la tuberculose se compose de deux domaines RNase III, qui lient chacun deux cations métalliques à travers quatre résidus acides conservés. La distance entre ces domaines correspond à l'étendue du squelette sucre-phosphate d'ARNdb et le clivage de l'ARNdb produit un surplomb en 3' de deux nucléotides. (6) Toutes ces caractéristiques sont cohérentes avec les domaines Giardia, montrant que les endoribonucléases RNaseIII sont hautement structurellement et fonctionnellement conservées. De nombreuses autres enzymes RNaseIII conservent ces caractéristiques. En plus de la similitude structurelle, Giardia Dicer présente des similitudes de séquence clé avec le domaine terminal de la ribonucléase III C des protéines RNase III eucaryotes, bactériennes et archéales, comme le révèle une requête BLAST. 5 des 5 résidus qui composent le site actif de la RNase III, 3 des 3 résidus qui composent le site de liaison au métal de la RNase III et 15 des 15 résidus qui composent l'interface de dimérisation de la RNase III mappée sur Giardia Dicer. Ces sites permettent à la fois aux enzymes R Nase III et à Dicer de se lier et de cliver l'ARNdb au niveau du site catalytique de l'interface de sous-unité.

    Giardia Dicer partage également des composants structurels avec Human Dicer. Human Dicer possède le domaine PAZ et deux domaines RNase III. Cependant, le Dicer humain possède également un domaine hélicase, un domaine dsRBD (liaison à l'ARN double brin) et un domaine DUF283 (domaine de fonction inconnue), qui ressemble au domaine de la plate-forme Giardia. (1) Human Dicer lie son substrat d'ARNdb avec une affinité plus élevée que Giardia Dicer, ce qui peut être attribué à ses caractéristiques supplémentaires et à sa structure plus complexe. (1) Une grande similitude structurelle existe entre les hélices alpha du connecteur de Giardia et de Human Dicer qui s'étendent sur la région entre les domaines PAZ et RNase III. Cette hélice alpha, à la fois chez l'humain et chez Giardia, consiste en une alternance de résidus hydrophobes et hydrophiles, et contient un résidu de proline créant un pli qui est nécessaire pour lier l'ARNdb de manière à positionner une extrémité entre les domaines de la RNase III. (1) Les domaines RNase III de Human Dicer ressemblent aux domaines Giardia RNase III. Comme dans Giardia, chaque domaine lie deux cations métalliques et produit un surplomb en 3' de deux nucléotides lors du clivage du substrat. (7) La portion RNase de Human Dicer est plus grande et plus complexe que celle de Giardia Dicer, mais leurs domaines RNase présentent une similitude structurelle significative.

    Mouse Dicer contient bon nombre des mêmes éléments structurels et domaines que Giardia Dicer. Un domaine Giardia Dicer RNase peut être superposé sur un domaine Mouse Dicer RNase. L'un des domaines RNase III de Mouse Dicer contient une région en hélice alpha et une région en boucle non présentes dans Giardia Dicer. Les souris et les souris humaines contiennent toutes deux cette hélice supplémentaire dans leurs domaines RNase IIIb, ce qui peut permettre des interactions supplémentaires avec l'ARNdb. (8) L'étude des domaines RNase III de souris Dicer a identifié un résidu lysine (K-1790) présent dans ce catalyseur Région. Le résidu lysine est un élément conservé des bactéries et Giardia Dicers et est impliqué dans la catalyse du clivage de la liaison phosphodiester. (8) La lysine fonctionnelle dans Mouse Dicer est K-1790. Cette lysine critique est conservée dans Giardia Dicer et apparaît comme K-400.

    Le domaine PAZ de la protéine humaine Argonaute est très similaire en structure et en fonction au domaine PAZ de Giardia Dicer. Argonaute fonctionne en aval de Dicer dans la voie de l'ARNi, il sert à lier l'ARNsi double brin au sein du complexe RISC. (9) Dans les deux protéines, les domaines PAZ fonctionnent dans la liaison au substrat d'ARNdb. La liaison à l'ARN dépend de la reconnaissance d'un surplomb de deux nucléotides en 3' dans le duplex. Argonaute, cependant, manque dans son domaine PAZ d'une boucle spécifique de Dicer riche en résidus basiques, qui fonctionne dans la liaison à l'extrémité 5' et peut servir à médier la liaison et la libération globales d'ARN de Dicer. (1) Une recherche sur le serveur Dali a révélé une similitude de séquence significative dans les domaines PAZ d'Argonaute2 et de Giardia Dicer. (11)


    Comment fonctionne l'ARNi

    Deux types de petites molécules d'ARN fonctionnent dans l'ARNi. Les premiers sont des molécules synthétiques d'ARN interférent court (ARNsi) qui ciblent le clivage de l'ARNm, inhibant efficacement l'expression d'un gène d'intérêt. Les molécules de microARN (miARN), d'autre part, sont des ARN simple brin d'origine naturelle de 19 à 22 nucléotides, qui régulent l'expression des gènes en se liant aux régions 3' non traduites (UTR) des ARNm cibles et en inhibant leur traduction (Ambros, 2004 ).

    Analyse siARN

    Il existe plusieurs façons d'induire l'ARNi : les molécules synthétiques, les vecteurs d'ARNi et in vitro dés (Figure 1, ci-dessous). Dans les cellules de mammifères, de courts morceaux d'ARNdb (ARN interférent court) initient la dégradation spécifique d'un ARNm cellulaire ciblé. Dans ce processus, le brin antisens de l'ARNsi devient une partie d'un complexe multiprotéique, ou complexe de silençage induit par l'ARN (RISC), qui identifie ensuite l'ARNm correspondant et le clive à un site spécifique. Ensuite, ce message clivé est ciblé pour la dégradation, ce qui entraîne finalement la perte de l'expression de la protéine.

    Figure 1: Méthodes de knockdown ARNi dans les cellules de mammifères.

    Analyse des miARN

    Les ARN polymérase II et III transcrivent des gènes contenant des miARN, générant de longs transcrits primaires (pri-miARN) qui sont traités par l'enzyme de type RNase III Drosha, produisant des structures en épingle à cheveux de 70 à 90 pb de longueur (pré-miARN). Les épingles à cheveux pré-miARN sont exportées vers le cytoplasme, où elles sont ensuite traitées par la protéine RNase III Dicer en de courts duplex de miARN double brin de 19 à 22 nucléotides de long. Le duplex miARN est reconnu par le complexe de silençage induit par l'ARN (RISC), un complexe multiprotéine nucléase, et l'un des deux brins, le brin guide, aide ce complexe protéique à reconnaître son transcrit d'ARNm apparenté. Le complexe RISC-miARN interagit souvent avec l'UTR 3' des ARNm cibles dans des régions présentant une homologie de séquence imparfaite, inhibant la synthèse des protéines par un mécanisme qui n'a pas encore été complètement élucidé (Figure 2, ci-dessous).

    Les miARN végétaux peuvent se lier aux séquences des ARNm cibles par un appariement de bases complémentaires exact ou quasi-exact et ainsi diriger le clivage et la destruction de l'ARNm (Rhoades et al., 2002 Chen, 2005). Semblable au mécanisme utilisé dans l'interférence ARN (ARNi), le clivage d'une seule liaison phosphodiester sur l'ARNm cible se produit entre les bases 10 et 11 (Elbashir et al., 2001). En revanche, presque tous les miARN animaux étudiés jusqu'à présent ne présentent pas une parfaite complémentarité avec leurs cibles ARNm et semblent inhiber la synthèse des protéines tout en conservant la stabilité de la cible ARNm (Ambros, 2004). Il a été suggéré que les transcrits peuvent être régulés par plusieurs miARN, et qu'un miARN individuel peut cibler de nombreux transcrits. La recherche suggère que jusqu'à un tiers des gènes humains peuvent être régulés par des miARN (Lim et al., 2003). Bien que des centaines de miARN aient été découverts dans une variété d'organismes, on sait peu de choses sur leur fonction cellulaire. Plusieurs attributs physiques uniques des miARN, y compris leur petite taille, l'absence de queues polyadénylées et la tendance à lier leurs cibles d'ARNm avec une homologie de séquence imparfaite, les ont rendus insaisissables et difficiles à étudier.

    Figure 2: Biogenèse et fonction des miARN. Les transcrits de microARN, générés par les ARN polymérases II et III, sont traités par les enzymes RNase III Drosha (nucléaire) et Dicer (cytoplasmique), produisant des duplex de miARN de 19 à 22 nucléotides. L'un des deux brins du duplex est incorporé dans le complexe RISC, qui régule l'expression des protéines.


    Un modèle simplifié pour la voie ARNi

    Un modèle simplifié de la voie ARNi est basé sur deux étapes, chacune impliquant l'enzyme ribonucléase. Dans la première étape, l'ARN déclencheur (soit l'ARNdb ou le transcrit primaire du miARN) est transformé en un court ARN interférent (ARNsi) par les enzymes RNase II Dicer et Drosha. Dans la deuxième étape, les siARN sont chargés dans le complexe effecteur RNA-Induit Silencing complex (RISC). L'ARNsi est déroulé lors de l'assemblage RISC et l'ARN simple brin s'hybride avec l'ARNm cible. Le silençage génique est le résultat de la dégradation nucléolytique de l'ARNm ciblé par l'enzyme RNase H Argonaute (Slicer). Si le duplex siARN/ARNm contient des mésappariements, l'ARNm n'est pas clivé. Au contraire, le silençage génique est le résultat d'une inhibition de la traduction.


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    Résultats de recherche : Contribution à la revue › Article › peer-review

    T1 - Analyse fonctionnelle des mutations faux-sens dicer-2 dans la voie siRNA de la drosophile

    N1 - Informations sur le financement : Nous remercions Qinghua Liu pour le don d'anticorps. Ce travail a été soutenu par la Korea Research Foundation Grant financée par le gouvernement coréen (MOEHRD, KRF-2006-331-C00213) et une Korea University Grant.

    N2 - L'enzyme RNase III de la drosophile Dicer-2 transforme les précurseurs d'ARN double brin (ARNdb) en petits ARN interférents (ARNsi). Il interagit également avec le produit siRNA et la protéine R2D2 pour faciliter l'assemblage d'un complexe de silençage induit par l'ARN (RISC) qui médie l'interférence ARN. Ici, nous avons caractérisé six mutations faux-sens indépendantes dans le gène dicer-2. Quatre mutations (P8S, L188F, R269W et P365L) dans le domaine hélicase DExH ont réduit l'activité de traitement de l'ARNdb. Deux mutations étaient localisées dans un domaine RNase III. P1496L a provoqué une perte d'activité de traitement de l'ARNdb comparable à une mutation nulle de dicer-2. A1453T a fortement réduit à la fois le traitement de l'ARNdb et l'activité RISC, et a diminué les niveaux de protéines Dicer-2 et R2D2, suggérant que cette mutation déstabilise Dicer-2. Nous avons également constaté que la région carboxy-terminale de R2D2 est essentielle pour la liaison Dicer-2. Ces résultats permettent de mieux comprendre la relation structure-fonction de Dicer, qui joue un rôle essentiel dans la voie des siARN.

    AB - L'enzyme Drosophila RNase III Dicer-2 transforme les précurseurs d'ARN double brin (dsRNA) en petits ARN interférents (siRNA). Il interagit également avec le produit siRNA et la protéine R2D2 pour faciliter l'assemblage d'un complexe de silençage induit par l'ARN (RISC) qui médie l'interférence ARN. Ici, nous avons caractérisé six mutations faux-sens indépendantes dans le gène dicer-2. Quatre mutations (P8S, L188F, R269W et P365L) dans le domaine hélicase DExH ont réduit l'activité de traitement de l'ARNdb. Deux mutations étaient localisées dans un domaine RNase III. P1496L a provoqué une perte d'activité de traitement de l'ARNdb comparable à une mutation nulle de dicer-2. A1453T a fortement réduit à la fois le traitement de l'ARNdb et l'activité RISC, et a diminué les niveaux de protéines Dicer-2 et R2D2, suggérant que cette mutation déstabilise Dicer-2. Nous avons également constaté que la région carboxy-terminale de R2D2 est essentielle pour la liaison Dicer-2. Ces résultats permettent de mieux comprendre la relation structure-fonction de Dicer, qui joue un rôle essentiel dans la voie des siARN.


    DISCUSSION

    Since the first discovery of the passenger-strand cleavage mechanism a decade ago, it has been widely recognized that slicer-dependent unwinding is a prerequisite for the assembly of highly complementary siRNAs into RISCs ( 10, 11, 13). Our collective results indicate that this assumption is typically valid, but not always, particularly for mammals and birds. Earlier biochemical studies relied mainly on target cleavage assays to understand the overall nature of RISC catalysis, which often tended to dismiss important differences during the early stages of RISC assembly. Through a careful re-examination of RISC assembly using a variety of several biochemical analyses, including duplex loading, slicer-dependent and -independent unwinding, and classical target cleavage assays, we established here that slicer-independent unwinding is a more prevalent mechanism for human RISC maturation than previously thought, not only for miRNA duplexes but also for highly complementary siRNAs as well. Aside from the main findings, there are several other findings that are important to discuss in detail.

    Small RNA sorting and the Mg 2+ level in slicer-dependent unwinding

    It has been previously recognized that only AGO2 can efficiently unwind siRNA duplexes via passenger-strand cleavage in humans ( 21), and this is reasonable in the sense that AGO2 is among the most advantageous human AGO proteins that can utilize its slicer-activity ( 42, 43) for RISC maturation (Figure 7E). Nonetheless, we showed that cleavage-deficient AGOs (1, 3, and 4) can also be programmed with siRNAs at the physiologically relevant temperature of humans, suggesting that slicer-independent unwinding is likely a common feature of human AGO proteins. These observations provided a natural explanation for why both miRNAs and siRNAs are found in all four human AGO proteins, irrespective of their sequences ( 44, 45). In contrast with weak small RNA sorting in humans, siRNA duplexes are specifically sorted into fly AGO2 ( 46, 47), which is essential for antiviral defense ( 48). The fly AGO2 should therefore acquire an additional strategy for siRNA maturation (i.e., passenger-strand cleavage), otherwise not efficient at their body temperature.

    We showed that a certain level of Mg 2+ is required for slicer-dependent unwinding to occur efficiently (Figure 2A). While the free cytosolic Mg 2+ level is less than 1 mM under normal conditions ( 49), the total cellular Mg 2+ concentration can vary from 5 to 20 mM ( 50, 51), as most Mg 2+ ions are bound to proteins and negatively charged molecules ( 50, 51). Therefore, it is difficult to estimate the exact amount of Mg 2+ bound to AGO2, although previous studies typically used 1.5–5 mM Mg 2+ for the in vitro slicing assays ( 10, 11, 42, 43, 52). In addition, cytosolic Mg 2+ levels can be altered by ATP, which is capable of chelating Mg 2+ ions ( 53). In other words, a transient decrease in ATP levels may give rise to a sudden increase in the Mg 2+ concentration ( 53). During two steps of RISC assembly, duplex loading requires ATP hydrolysis, and subsequent cleavage of the passenger-strand requires a relatively high level of Mg 2+ . It is tempting to speculate that bursts of metabolic activity during pre-RISC formation may induce a transient decrease in ATP that results in an increase in Mg 2+ levels that allows for more efficient slicer-activity, although it is technically difficult to demonstrate such rapid and transient changes.

    Slicer-independent unwinding in human RISCs

    Although chaperone machinery-mediated duplex loading is relatively well understood ( 3–6), it is still remain elusive how the loaded duplex unwinds to form the mature RISC. The helicase model was proposed at the beginning of the RNAi field — an ATP-dependent helicase separates the two strands of the duplex before they are loaded into the AGO protein ( 30), although such an ‘unwindase’ has yet to be identified ( 2). Another model assumes that duplexes are loaded into the AGO protein, which itself can dissociate the two strands ( 2, 18, 19, 22). Our findings, combined with those of previous studies, point to the latter model as a more plausible scenario. It has been extensively demonstrated that AGO proteins receive duplexes, rather than single strands, during RISC assembly ( 4, 5, 10–13, 19, 21). Once a duplex is deeply buried within the AGO protein, it is difficult to comprehend how the duplex is further transferred from AGO proteins to other regulatory factors in an accessible form. We showed that the unwinding process was significantly influenced by intrinsic factors, such as temperature and Mg 2+ , both of which were closely related to duplex stability. Our functional analyses also indicated that the AGO protein itself is a key factor that is needed for duplex unwinding. Recent structural studies have corroborated the idea that target dissociation is strongly coupled to a profound conformational change in the AGO proteins, which results in a widening of the N-PAZ channel, thereby leading to a disruption of the base-pairing in the 3′ half of the guide ( 54, 55). We postulate that high temperature may favor a conformational change ( 56, 57) in the AGO protein that accelerates RISC maturation.

    miRNAs are the most abundant and common endogenous substrates for human AGOs and they often have multiple mismatches and G-U wobble base pairs (or even bulges) that enable highly efficient unwinding (Figure 7E and Supplementary Figure S6E). In contrast, a highly complementary siRNA duplex requires either a certain temperature or AGO2-mediated cleavage of passenger-strands, which results in a drastic change in the thermodynamic profile of the duplex. siRNA unwinding by AGO2 depends upon two main factors with opposite effects: temperature and Mg 2+ (Figure 7E). At the physiological temperature of humans, siRNAs could also be incorporated into slicer-deficient AGOs (1, 3 and 4) to form the mature RISC (Figure 7E). In mammals, endogenous siRNAs can repress complementary mRNAs and transposons in mouse oocytes ( 58) and embryonic stem cells ( 59), although little is known about their biological role.

    A thermodynamic perspective of RISC maturation

    In light of our current findings, as well as those of previous reports, we envision that the overall process of RISC assembly has characteristics closely resembling those of a classical thermodynamic reaction (Supplementary Figure S7). Duplex loading requires the energy from ATP hydrolysis (i.e. Eune) to trigger a conformational change in the AGO proteins that is mediated by the Hsc70–Hsp90 chaperone machinery ( 3–6). In this regards, the pre-RISC can be considered to be a transition state during RISC assembly (Supplementary Figure S7). The mature RISC is thought to be the most stable and energetically favorable state (ΔH < 0) (Supplementary Figure S7). This assumption is supported by the fact that AGO proteins mostly co-purify with endogenous guide RNAs and were stable enough to be structurally resolved by crystallography ( 33, 34, 54, 60).

    Because duplex unwinding is generally accompanied by an increase in entropy ( 61, 62) (ΔS > 0), the spontaneity (Δg = ΔHT??S) of RISC maturation is then largely influenced by the temperature that contributes to the entropy of the system. Although this may seem to be plausible, we cannot warrant further speculation with our present biochemical data alone. Future studies combining structural analyses with biophysical techniques are necessary to reveal the structural basis for duplex unwinding, as well as its thermodynamics.

    Homeotherms, such as mammals and birds, have a specific physiological adaptation that enables them to regulate their body temperature from 36 to 42°C ( 63). In contrast, poikilotherms, including worms, flies, plants, and fish, lack the means to generate heat ( 64). Therefore, the body temperatures of these animals tend to conform to their external environment, and temperature fluctuations may affect numerous aspects of their physiology, including enzyme function, muscle activity, and energy metabolism ( 64). Our results suggested that the last step of small RNA biogenesis could be largely influenced by such temperature changes, which may provide a means to fine-tune the expression of small RNAs in various living organisms.