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15.9 : Vidéo - La moelle épinière non fixée - Biologie


15.9 : Vidéo – La moelle épinière non fixée

Laboratoire vidéo de neuroanatomie : Dissections cérébrales

Cette série de « leçons » de neuroanatomie a deux objectifs principaux. Le premier est de fournir aux téléspectateurs un accès à des spécimens de cerveau humain, ce qui fait défaut dans de nombreux endroits. La seconde consiste à simplifier l'anatomie, en omettant de nombreux détails et en faisant de nombreuses généralisations. La raison en est de garder l'accent sur la localisation de la maladie du patient dans le système nerveux. Les étudiants sont souvent submergés par des détails excessifs, ce qui rend la corrélation de la structure et de la fonction plus difficile. La séquence de présentation est dans un ordre logique pour une classe, mais chaque vidéo est conçue pour être autonome et être utilisée juste à temps pour faire un point clinique.

La série est née lors de l'enseignement avec un neurologue au Ghana et au Kenya où il était clair que l'anatomie enseignée séparée de la clinique par de nombreuses années n'était pas retenue. Je présente ici juste assez d'anatomie pour localiser le problème du patient. Ces vidéos peuvent être utilisées avant ou après une présentation de cas clinique. Des excuses sont présentées pour quelques erreurs mineures qui n'ont pas pu être corrigées en raison de l'opportunité d'enregistrement unique ainsi que d'un style personnel non scénarisé. Le public de ces vidéos peut être composé d'infirmières, d'assistants médicaux, d'étudiants en médecine, de résidents, de greffiers, d'agents internes ou de toute personne intéressée par le cerveau.

Les vidéos peuvent également être utilisées en conjonction avec le site Web NeurologicExam → Toutes les vidéos ont des légendes en anglais pour aider ceux dont l'anglais n'est pas leur langue maternelle ou pour visualiser les nombreux nouveaux termes.


Critiques éditoriales

Revoir

⋎t atlas fournit une excellente carte détaillée de l'ensemble de la moelle épinière du rat et de la souris. Les photomicrographies sont exceptionnelles, l'étiquetage est clair et les illustrations devraient servir d'exemples exceptionnels de ce à quoi devraient ressembler une coloration et une immunocytochimie de haute qualité. Cette information n'était disponible dans aucun atlas du SNC auparavant, et sera une ressource extrêmement utile pour tous les neuroscientifiques intéressés par cette partie du système nerveux et un « incontournable » pour les laboratoires de la moelle épinière."

Jacqueline C. Bresnahan, professeur, Département de chirurgie neurologique, Brain and Spinal Injury Center, Université de Californie à San Francisco, États-Unis

"La moelle épinière est un compte rendu détaillé et faisant autorité du développement, de l'organisation et de la fonction de la moelle épinière. Écrit par une série d'experts, le livre contient des chapitres éclairants qui couvrent l'anatomie et l'architecture de la moelle épinière de manière claire et logique. L'attention portée à des sujets particuliers, tels que les lésions de la moelle épinière et la miction, est sans précédent et exceptionnellement informative. L'atlas complet, ainsi que les diagrammes et la liste des références, seront d'une utilité considérable pour les étudiants du système nerveux, ainsi que pour les chercheurs les plus expérimentés. C'est un excellent volume !"

Moses V. Chao, professeur de biologie cellulaire, physiologie, neurosciences et psychiatrie, programme de neurobiologie moléculaire, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU School of Medicine, New York, États-Unis

Revoir

A propos de l'auteur

Charles Watson est neuroscientifique et médecin de santé publique. Ses qualifications comprenaient un diplôme de médecine (MBBS) et deux doctorats de recherche (MD et DSc). Il est professeur émérite à l'Université Curtin et occupe des postes de professeur adjoint de recherche à l'Université de Nouvelle-Galles du Sud, à l'Université du Queensland et à l'Université d'Australie occidentale.
Il a publié plus de 100 articles de revues à comité de lecture et 40 chapitres de livres, et a co-écrit plus de 25 livres sur l'anatomie du cerveau et de la moelle épinière. L'atlas du cerveau du rat Paxinos Watson a été cité plus de 80 000 fois. Ses recherches actuelles portent sur l'anatomie comparée de l'hippocampe et du claustrum.
Il a reçu le diplôme de docteur ès sciences de l'Université de Sydney en 2012 et a reçu le Distinguished Achievement Award de l'Australasian Society for Neuroscience en 2018.

Le professeur George Paxinos, AO (BA, MA, PhD, DSc) a obtenu son BA à l'Université de Californie à Berkeley, son doctorat à l'Université McGill et a passé une année postdoctorale à l'Université Yale. Il est l'auteur de près de 50 livres sur la structure du cerveau des humains et des animaux de laboratoire, dont The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, actuellement dans sa 7e édition, qui est classé par Thomson ISI comme l'un des 50 articles les plus cités dans le Web de la Science. Le Dr Paxinos a ouvert la voie à de futures recherches en neurosciences en étant le premier à produire un cadre tridimensionnel (stéréotaxique) pour le placement d'électrodes et d'injections dans le cerveau d'animaux de laboratoire, qui est maintenant utilisé comme norme internationale. Il a été membre du premier Consortium international pour la cartographie du cerveau, un consortium basé à l'UCLA qui a reçu le premier rang et a été financé par le Human Brain Project dirigé par le NIMH. Le Dr Paxinos a été honoré de plus de neuf prix distingués au cours de ses années de recherche, notamment : le Warner Brown Memorial Prize (Université de Californie à Berkeley, 1968), le Walter Burfitt Prize (1992), le Award for Excellence in Publishing in Medical Science (Assoc Amer Publishers, 1999), The Ramaciotti Medal for Excellence in Biomedical Research (2001), The Alexander von Humbolt Foundation Prize (Allemagne 2004), et plus encore. --Ce texte fait référence à l'édition à couverture rigide.


  • Editorial &rlm : &lrm Academic Press Edición Illustrated (12 novembre 2008)
  • Idioma &rlm : &lrm Francés
  • Pâtes dura &rlm : &lrm 387 pages
  • ISBN-10 &rlm : &lrm 0123742471
  • ISBN-13 &rlm : &lrm 978-0123742476
  • Dimensions &rlm : &lrm 21,84 x 2,79 x 27,94 cm

Críticas

Cet atlas fournit une excellente carte détaillée de l'ensemble de la moelle épinière du rat et de la souris. Les photomicrographies sont exceptionnelles, l'étiquetage est clair et les illustrations devraient servir d'exemples exceptionnels de ce à quoi devraient ressembler une coloration et une immunocytochimie de haute qualité. Cette information n'était disponible dans aucun atlas du SNC auparavant, et sera une ressource extrêmement utile pour tous les neuroscientifiques intéressés par cette partie du système nerveux et un « incontournable » pour les laboratoires de la moelle épinière. --Jacqueline C. Bresnahan, professeur, Département de chirurgie neurologique, Brain and Spinal Injury Center, Université de Californie à San Francisco, États-Unis

La moelle épinière est un compte rendu détaillé et faisant autorité du développement, de l'organisation et de la fonction de la moelle épinière. Écrit par une série d'experts, le livre contient des chapitres éclairants qui couvrent l'anatomie et l'architecture de la moelle épinière de manière claire et logique. L'attention portée à des sujets particuliers, tels que les lésions de la moelle épinière et la miction, est sans précédent et exceptionnellement informative. L'atlas complet, ainsi que les diagrammes et la liste de références, seront d'une grande utilité pour les étudiants du système nerveux, ainsi que pour les chercheurs les plus expérimentés. C'est un excellent tome ! --Moses V. Chao, professeur de biologie cellulaire, physiologie, neurosciences et psychiatrie, programme de neurobiologie moléculaire, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU School of Medicine, New York, États-Unis

Biographie de l'auteur

Charles Watson est neuroscientifique et médecin de santé publique. Ses qualifications comprenaient un diplôme de médecine (MBBS) et deux doctorats de recherche (MD et DSc). Il est professeur émérite à l'Université Curtin et occupe des postes de professeur adjoint de recherche à l'Université de Nouvelle-Galles du Sud, à l'Université du Queensland et à l'Université d'Australie occidentale.
Il a publié plus de 100 articles de revues à comité de lecture et 40 chapitres de livres, et a co-écrit plus de 25 livres sur l'anatomie du cerveau et de la moelle épinière. L'atlas du cerveau du rat Paxinos Watson a été cité plus de 80 000 fois. Ses recherches actuelles portent sur l'anatomie comparée de l'hippocampe et du claustrum.
Il a reçu le diplôme de docteur ès sciences de l'Université de Sydney en 2012 et a reçu le Distinguished Achievement Award de l'Australasian Society for Neuroscience en 2018.

Le professeur George Paxinos, AO (BA, MA, PhD, DSc) a obtenu son BA à l'Université de Californie à Berkeley, son doctorat à l'Université McGill et a passé une année postdoctorale à l'Université Yale. Il est l'auteur de près de 50 livres sur la structure du cerveau des humains et des animaux de laboratoire, dont The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, actuellement dans sa 7e édition, qui est classé par Thomson ISI comme l'un des 50 articles les plus cités dans le Web de la Science. Le Dr Paxinos a ouvert la voie à de futures recherches en neurosciences en étant le premier à produire un cadre tridimensionnel (stéréotaxique) pour le placement d'électrodes et d'injections dans le cerveau d'animaux de laboratoire, qui est maintenant utilisé comme norme internationale. Il a été membre du premier Consortium international pour la cartographie du cerveau, un consortium basé à l'UCLA qui a reçu le premier rang et a été financé par le Human Brain Project dirigé par le NIMH. Le Dr Paxinos a été honoré de plus de neuf prix distingués au cours de ses années de recherche, notamment : le Warner Brown Memorial Prize (Université de Californie à Berkeley, 1968), le Walter Burfitt Prize (1992), le Award for Excellence in Publishing in Medical Science (Assoc Amer Publishers, 1999), The Ramaciotti Medal for Excellence in Biomedical Research (2001), The Alexander von Humbolt Foundation Prize (Allemagne 2004), et plus encore.


La moelle épinière murine postnatale représente un bon système modèle pour étudier la myélinisation du système nerveux central des mammifères in vivo comme base pour d'autres études sur les maladies démyélinisantes.

Les changements transcriptionnels ont été analysés chez des souris SJL/J aux jours postnatals 0, 14, 49 et 231 (P0, P14, P49, P231) en utilisant des matrices Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0. De plus, des signatures de gènes marqueurs pour les stades de lignées d'astrocytes et d'oligodendrocytes ont été définies pour étudier leur expression génique plus en détail. De plus, l'immunohistochimie a été utilisée pour quantifier l'abondance des marqueurs de cellules gliales couramment utilisés.

6092 gènes différentiellement régulés (DEG) ont été identifiés. Les DEG régulés à la hausse à P14, P49 et P231 par rapport à P0 présentaient des associations significativement enrichies avec des termes d'ontologie génique tels que la myélinisation et le transport métabolique des lipides et des DEG régulés à la baisse pour la neurogenèse et l'axonogenèse. Les valeurs d'expression des signatures de gènes marqueurs pour les cellules souches neurales, les cellules précurseurs d'oligodendrocytes et les astrocytes en développement diminuaient constamment, tandis que les marqueurs d'oligodendrocytes myélinisants et d'astrocytes matures montraient une augmentation constante. Les découvertes moléculaires ont été corroborées par des observations immunohistochimiques.

Les changements transcriptionnels observés sont une référence importante pour l'analyse future des conditions dégénératives et inflammatoires de la moelle épinière.


Résultats

Kv3.1b est localisé aux nœuds de Ranvier dans le CNS

Le gène Kv3.1 donne naissance à deux sous-unités de canaux distinctes, Kv3.1a et Kv3.1b, par épissage alternatif (Luneau et al., 1991). Leurs séquences protéiques prédites ne divergent qu'au niveau de leurs terminaisons C. Nous nous sommes concentrés sur le Kv3.1b car il est bien plus abondant que le Kv3.1a dans le cerveau du rat adulte (Perney et al., 1992 Gan et Kaczmarek, 1998). Nos investigations préliminaires ont révélé que les cryosections de moelle épinière non fixée ont une coloration Kv3.1b plus forte que les tissus fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % ou le fixateur de Zamboni, et que la matière grise était fortement colorée. Pour localiser les nœuds de Ranvier, nous avons coloré des coupes transversales de moelle épinière de souris adulte non fixée avec un antisérum de lapin contre Kv3.1b ou Kv3.2 et un anticorps monoclonal de souris qui reconnaît une séquence commune à tous les Nav sous-unités du canal α. Une faible coloration Kv3.2 a été observée dans la substance grise de la moelle épinière, mais pas dans la substance blanche (données non présentées). Comme le montre la figure 1A𠄿 , de nombreux nœuds ont été marqués pour Kv3.1b dans toutes les voies de la substance blanche, mais la proportion de nœuds Kv3.1b-positifs différait ( Fig. 2UNE ). Dans la colonne latérale ( Fig. 1UN B ) et le funicule ventral ( Fig. 1CD ), presque tous les nœuds ont été co-étiquetés pour Nav et canaux Kv3.1b. En revanche, dans le tractus corticospinal ( Fig. 1E, F ), relativement moins de nœuds ont été étiquetés pour Kv3.1b. Lorsqu'ils sont observés à fort grossissement, Kv3.1b et Nav la coloration des canaux est apparue circulaire, confirmant qu'ils étaient exprimés au niveau des nœuds ( Fig. 3A𠄼 , encarts). De plus, en coupes longitudinales, la coloration Kv3.1b correspondait précisément à celle de Nav canaux ( Fig. 3A𠄼 , doubles pointes de flèche). La coloration pour Kv3.1b était spécifique car elle a été abolie en préincubant l'antisérum avec le peptide (données non présentées). De plus, aucune coloration Kv3.1b n'a été trouvée chez les souris déficientes en Kv3.1 (Fig. 1G, H ), qui manquent à la fois des isoformes Kv3.1a et Kv3.1b (Ozaita et al., 2002).

Localisation de Kv3.1b dans la moelle épinière de souris adulte. Des sections transversales de moelle épinière thoracique non fixée ont été doublement marquées avec un antisérum de lapin Kv3.1b [isothiocyanate de tétraméthylrhodamine (TRITC)] et un anticorps monoclonal &# x0201cpan&# x0201d (FITC) contre Nav canaux (panNav). Dans le latéral (UN B) et ventrale (C, D) colonnes de la moelle épinière, la majorité des nœuds étaient doublement marqués, mais dans la colonne dorsale (dc) et surtout dans le tractus corticospinal (cst) (E, F), seul un sous-ensemble de nœuds était Kv3.1b-positif. Notez la coloration intense pour Kv3.1b dans la corne dorsale (dh) et la corne ventrale (vh) de la moelle épinière. Chez la souris déficiente en Kv3.1 (-/-), aucun étiquetage n'a été observé pour Kv3.1b (la colonne ventrale est représentée) (G, H). Barre d'échelle, 20 μm.

Marquage Kv3.1b dans la moelle épinière, le nerf optique et le DRG de souris adultes. Coupes longitudinales de la colonne ventrale (A𠄼) et la corne dorsale (G–I) de la moelle épinière, ainsi que du nerf optique (D𠄿) et DRG (J–L), double-marqué avec un antisérum de lapin Kv3.1b (TRITC) et un anticorps monoclonal (FITC) contre Nav canaux (panNav) sont indiqués. Dans A𠄼, Kv3.1b est colocalisé exclusivement avec Nav canaux dans les nœuds (doubles pointes de flèche). L'encart montre un nœud dans une coupe transversale. Dans D𠄿, quelques nœuds étaient Kv3.1b-positifs. Dans G–I, Kv3.1b semble être exprimé, au moins en partie, dans la membrane somatique des neurones, mais n'était pas colocalisé avec Nav canaux dans les segments initiaux (flèches). Dans J–L, de nombreux soma expriment Nav canaux, mais peu ont exprimé Kv3.1b. Les flèches indiquent les segments initiaux. Barres d'échelle : (en C) A𠄼, 20 μm (en F) D𠄿, 20 μm (en je) G–I, 20 μm (en L) J–L, 20 μm (en C, encart) A𠄼, encarts, 5 μm.

Relation entre l'expression de Kv3.1b et le diamètre nodal dans le funicule dorsal et ventral de la moelle épinière de souris adulte. Le nombre de nœuds et de nœuds Kv3.1b-positifs sont représentés en fonction de la plage de diamètre nodal pour la dorsale (C) et ventrale () funicule. Dans B, le pourcentage de ganglions Kv3.1b-positifs dans l'ensemble de la moelle épinière est représenté en fonction de la plage de diamètre nodal. Notez que presque tous les gros nœuds (ϡ.8 μm) sont Kv3.1b-positifs, alors que 7�% des petits nœuds (ρ.8 μm) sont Kv3.1b-négatifs, et que Kv3.1b est plus représenté dans les petits nœuds du funicule ventral que dans le funicule dorsal. Les données ont été obtenues à partir de deux souris et sont représentées par des moyennes ± SD m = 1394.

Nous avons suspecté que la raison de la variation de la coloration nodale était la variation de la composition des axones dans les différentes voies. En particulier, la taille des axones myélinisés semblait être en corrélation avec la coloration nodale Kv3.1b. Le CST contient de nombreux petits axones myélinisés (Hildebrand, 1972 Murray et Blakemore, 1980 Chung et Coggeshall, 1987), tandis que les funicules ventral et latéral contiennent de nombreux grands axones myélinisés. Pour résoudre ce problème, nous avons immunocoloré des sections de nerfs optiques de souris et de rat, qui contiennent principalement de petites fibres myélinisées (Matheson, 1970), et avons constaté que 14% des nœuds étaient marqués pour Kv3.1b. Les nœuds colorés semblaient avoir un diamètre plus grand que les nœuds non marqués (Fig. 3D𠄿 ). Pour confirmer que l'expression de Kv3.1b est liée au diamètre des fibres, une étude quantitative a été réalisée et le nombre de nœuds et de nœuds Kv3.1b positifs par rapport à la plage de diamètre des nœuds a été mesuré. Nous avons constaté que presque tous les nœuds d'un diamètre ϡ.8 mm étaient Kv3.1b-positifs, alors que 54 à 93% des nœuds ayant un diamètre ρ.8 mm étaient Kv3.1b-positifs (Fig. 2B ). Ces données soutiennent une relation entre le diamètre axonal et la localisation nodale de Kv3.1b. Cependant, comme les petits nœuds du funicule ventral sont plus souvent Kv3.1b-positifs que ceux du funicule dorsal (Fig. 3C,D ), il semble que d'autres facteurs influencent également l'expression de Kv3.1b.

Parce que les nœuds et les segments initiaux ont tous deux de l'ankyrine G et Nav canaux, nous avons déterminé si Kv3.1b était exprimé dans les segments axonaux initiaux en marquant des sections longitudinales de la moelle épinière ainsi que des sections de ganglions de la racine dorsale. Bien que la matière grise ait été intensément marquée (correspondant probablement à une coloration de surface des somes et des terminaisons présynaptiques) (Sekirnjak et al., 1997), les segments initiaux n'étaient pas colorés (Fig. 3G–I ). Les neurones sensoriels des ganglions dorsaux, en revanche, présentaient peu de coloration Kv3.1b, ce qui peut être lié à l'absence de synapses sur leurs corps cellulaires (Fig. 3J–L ). Comme dans la moelle épinière, les segments initiaux des neurones sensoriels étaient Kv3.1b-négatifs.

Localisation de Kv3.1b et Kv3.2 dans le PNS

Nous avons examiné la localisation de Kv3.1b et Kv3.2 dans des fibres taquinées de nerfs sciatiques de souris adultes. Les nœuds PNS étaient Kv3.2-négatifs (données non présentées), et seulement 23% des nœuds exprimaient Kv3.1b (Fig. 4UN B ), le marquage même dans ces nœuds était moins intense que celui dans le SNC. Lorsqu'il était possible de suivre des fibres individuelles, nous avons observé que tous les nœuds étaient soit colorés soit non colorés, suggérant que Kv3.1b était exprimé dans un sous-ensemble spécifique de fibres, peut-être lié à leur fonction. Pour élucider ce point, nous avons coloré les fibres taquinées des racines dorsales et ventrales, mais avons trouvé des nœuds Kv3.1-positifs dans les fibres de petit et de grand diamètre des racines dorsales et ventrales (données non présentées). Nous avons également examiné le développement de l'expression de Kv3.1b dans les racines dorsales et ventrales. À P4 et P8, aucune coloration nodale n'a été observée, certains amas ont été observés à P12, et beaucoup plus à P15 et P21 (données non présentées). Ces observations excluent la possibilité que les nœuds PNS perdent l'expression de Kv3.1 au cours du développement. Ainsi, la signification fonctionnelle des ganglions SNP Kv3.1b-positifs reste à établir.

Peu de nœuds PNS expriment Kv3.1b. Les fibres taquinées non fixées du nerf sciatique de souris adulte ont été doublement marquées avec un antisérum de lapin Kv3.1b (TRITC,UNE) et un anticorps monoclonal contre Nav canaux (FITC, B). Un nœud Kv3.1b-positif est indiqué (doubles pointes de flèches) deux autres nœuds sont Kv3.1b-négatif. Barre d'échelle, 10 μm.

Parce que les neurones moteurs et sensoriels ont des fibres myélinisées avec la myéline du SNC et du SNP, nous avons examiné des sections de la zone d'entrée de la racine ventrale, la zone de transition entre le SNC et la myéline du SNP pour les fibres motrices. Les sections co-étiquetées pour Kv3.1b et Kv1.2 montrent que les ganglions Kv3.1b-positifs sont trouvés dans la moelle épinière mais pas dans les racines, alors que des juxtaparanodes Kv1.2-positifs ont été trouvés aux deux endroits ( Fig. 5A𠄼 ). Ainsi, le fort marquage nodal de Kv3.1b dans les axones moteurs semble dépendre d'un certain aspect de l'environnement du SNC, vraisemblablement lié aux oligodendrocytes ou aux astrocytes.

Localisation différentielle de Kv3.1b et Kv1.2 dans les axones du SNC. Ce sont des images de coupes longitudinales de la colonne ventrale (vc) de la moelle épinière lombaire non fixée de souris adultes. Dans la moelle épinière, la bande étroite de la coloration nodale Kv3.1b (TRITC UNE) est flanqué de deux régions plus larges de coloration juxtaparanodale Kv1.2 (FITC B). C, Fusionner. Notez le manque relatif d'étiquetage pour Kv3.1b dans les nœuds PNS (doubles pointes de flèche) de la radicelle ventrale (vr). Barre d'échelle, 10 μm.

Expression développementale de Kv3.1b

Ankyrin G est le premier composant moléculaire qui se localise dans le développement des nœuds du SNC Nav canaux, L1, neurofascine et βIV-spectrine sont recrutés plus tard (Jenkins et Bennett, 2001). Pour déterminer quand Kv3.1b est localisé aux nœuds, nous avons immunocoloré des sections transversales de la moelle épinière thoracique de rats à P4, P8, P12 et P21. À P4, il y avait des amas de Nav canaux dans les colonnes ventrale et latérale ( Fig. 6B ), mais pas de coloration Kv3.1b dans la matière blanche ou même la matière grise ( Fig. 6UNE ). À P8, il y avait une faible coloration Kv3.1b dans la matière grise et des amas de Kv3.1b dans une minorité de nœuds de la colonne ventrale ( Fig. 6CD ). Dans les sections longitudinales de la colonne ventrale, Kv3.1b semblait être sélectivement localisé aux nœuds « matures » (nœuds courts plutôt que allongés Rasband et al., 1999a). À P12, le nombre, ainsi que l'intensité de coloration des ganglions Kv3.1b-positifs ont augmenté de façon marquée ( Fig. 6E, F ), et dans les coupes longitudinales, les clusters Kv3.1b apparaissaient principalement dans des nœuds courts d'apparence mature ( Fig. 7UNE ). À P21, la distribution des nœuds Kv3.1b-positifs ( Fig. 6G, H ) est apparu similaire à celui des rats adultes.

Apparition retardée de Kv3.1b aux nœuds du SNC. Ce sont des images montrées comme des négatifs (les nœuds sont sombres) de sections transversales de moelle épinière thoracique non fixée de P4 (UN B) P8 (C, D), P12 (E, F) et P21 (G, H) les rats. La colonne ventrale (vc) est illustrée, ainsi que la corne ventrale (vh) dans A𠄿. Au P4, Nav les canaux mais pas les canaux Kv3.1b ont été regroupés. Les clusters Kv3.1b étaient présents par P8, et leur nombre, ainsi que celui de Nav canaux, augmenté de P4 à P21. À P21, les nœuds ont été étiquetés à la fois pour Nav canaux et Kv3.1b. Barres d'échelle : (en B) UN B, 20 μm (en H) B–H, 20 μm.

Kv3.1b apparaît avant Kv1.2 dans les fibres myélinisées du SNC. Ce sont des coupes longitudinales de la colonne ventrale de la moelle épinière lombaire ventrale de rat non fixée à P12 (UNE), P15 (B) et P21 (C). À P12 et P15, la coloration ganglionnaire Kv3.1b n'était souvent pas associée à une coloration juxtaparanodale Kv1.2, alors qu'à P21, la plupart des nœuds étaient flanqués d'un marquage juxtaparanodal Kv1.2. Barres d'échelle, 10 μm.

Nous avons envisagé la possibilité que Kv3.1b puisse se regrouper en même temps que les sous-unités Kv1.1/Kv1.2. Kv1.1 et Kv1.2 sont les derniers canaux à être séparés dans le développement du SNC (Rasband et al., 1999b), à environ P8 dans la moelle épinière (Wang et al., 1995), et leur regroupement dans la région juxtaparanodale dépend sur la formation de gaines de myéline normales, en particulier les jonctions intactes de type cloisonné (Baba et al., 1999 Mathis et al., 2001 Arroyo et al., 2002). Des coupes longitudinales à travers les colonnes ventrales de la moelle épinière lombaire des rats P4, P8, P12, P15 et P21 ont été doublement marquées pour Kv3.1b et Kv1.2. Aucune coloration pour Kv1.2 n'a été observée à P4 dans la moelle épinière, et quelques grappes de Kv1.2 ont été observées à P8 (données non présentées). À P12, la plupart des ganglions Kv3.1b-positifs n'avaient pas de coloration Kv1.2 associée ( Fig. 7UNE ). À P15, la proportion de ganglions Kv3.1b positifs associés à la coloration Kv1.2 a augmenté, et à P21, tous les ganglions Kv3.1b positifs étaient flanqués d'une coloration juxtaparanodale Kv1.2 (Fig. 7AVANT JC ). Ensemble, ces résultats montrent que le regroupement des canaux ioniques dans les fibres myélinisées suit l'ordre : Nav canaux, puis les sous-unités Kv3.1b, puis les sous-unités Kv1.2.

Le clustering nodal de Kv3.1b dépend-il de la myélinisation ?

Pour répondre à cette question, nous avons étudié la localisation de Kv3.1b dans Maryland les rats, qui meurent généralement à environ P21 d'une dysmyélinisation sévère associée à la mort cellulaire des oligodendrocytes (Grinspan et al., 1998). Même à cet âge, peu d'axones sont myélinisés dans la moelle épinière. Arroyo et al., 2002). Néanmoins, leurs moelles épinières contiennent un nombre normal de grappes de Nav canaux et ankyrine G, même dans les régions dépourvues d'oligodendrocytes (Arroyo et al., 2002). Comme le montre la figure 8, Kv3.1b et Nav canaux ont été colocalisés dans la moelle épinière de P21 Maryland les rats (A𠄼) et leurs congénères WT du même âge (D𠄿). Le double étiquetage pour MAG a démontré que certains clusters de type nœud de Kv3.1b étaient flanqués de segments gainés de MAG, mais beaucoup ont été trouvés dans des segments axonaux non gainés (Fig. 8g ). En revanche, la localisation des sous-unités Kv1.2 a été fortement altérée dans Maryland rats : les sous-unités de Kv1.2 étaient contiguës aux amas de type nœud de Kv3.1b (Fig. 8H ) au lieu d'être concentrés dans les régions juxtaparanodales comme chez les rats WT ( Fig. 8je ). Ces résultats montrent que les clusters de type nœud de Kv3.1b se comportent de manière similaire aux clusters de Nav canaux dans Maryland rats (Arroyo et al., 2002) : les deux sont formés au cours du développement et maintenus au moins temporairement même en l'absence de gaines de myéline.

Clusters de type nœud de Kv3.1b dans Maryland les rats. Coupes longitudinales à travers le funicule ventral de la moelle épinière lombaire non fixée de P21 Maryland les rats et leurs congénères mâles WT ont été doublement marqués avec un antisérum de lapin Kv3.1b (TRITC) et un anticorps monoclonal (FITC) contre Nav canaux (pan Nav A𠄿), MAG (g), ou Kv1.2 (SALUT). Dans A𠄿, notez que dans les deux Maryland et rats WT, clusters de type nœud Kv3.1b colocalisés avec Nav canaux (doubles flèches). Dans g, notez que de nombreux clusters de type nœud de Kv3.1b (pointes de flèches) ont été trouvés dans des régions dépourvues de processus d'oligodendrocytes MAG-positifs. Les astérisques marquent les noyaux d'oligodendrocytes. Dans SALUT, notez que la localisation de Kv1.2 (flèches) a été modifiée dans Maryland rats, contigus aux clusters en forme de nœud de Kv3.1b (doubles flèches). Barres d'échelle : (en C) A𠄼, 10 μm (en F) D𠄿, 10 μm g, 10 μm H, 10 μm je, 10 μm.

Kv3.1b est associé à l'ankyrine G dans les membranes cérébrales

La colocalisation de Kv3.1b, Nav canaux, et l'ankyrine G dans les nœuds du SNC suggèrent que Kv3.1b peut interagir directement ou indirectement avec l'ankyrine G. Les isoformes nodales de l'ankyrine G interagissent avec plusieurs protéines nodales telles que Nav sous-unités des canaux α et β, la neurofascine et la CAM liée aux neurones-gliales (NrCAM) (Malhotra et al., 2000 Bennett et Chen, 2001). Pour déterminer le niveau d'expression de Kv3.1b et Kv3.2 dans le cerveau, la moelle épinière, le nerf optique et le nerf sciatique, nous avons effectué une analyse Western blot de ces tissus (Fig. 9). Le cerveau et la moelle épinière du rat ont exprimé plus de Kv3.1b que le nerf optique. Kv3.1b n'a pas pu être détecté dans le nerf sciatique du rat. L'antisérum anti-Kv3.1b a reconnu une bande diffuse de �� kDa, significativement supérieure aux 66 kDa attendus pour le polypeptide Kv3.1b obtenu par traduction de l'ADNc Kv3.1b (Luneau et al., 1991), mais en bon accord avec les résultats de Weiser et al. (1995) sur les membranes cérébrales du rat. Cette bande est presque certainement Kv3.1b, car elle est absente dans les membranes cérébrales des souris déficientes en Kv3.1b (Fig. 9UNE ). Kv3.2 a également été détecté dans les membranes cérébrales, et dans une moindre mesure dans la moelle épinière, avec une plage de poids moléculaire de 75� kDa ( Fig. 9B ). Cependant, Kv3.2 n'a pas été détecté dans les nerfs optiques et sciatiques, en accord avec l'immunocoloration. Nous n'avons pas détecté d'altérations de la coloration Kv3.2 dans la moelle épinière ou le cerveau de souris déficients en Kv3.1 en particulier, les nœuds n'étaient pas Kv3.2-positifs (données non présentées). De plus, nous n'avons détecté aucune altération dans l'étiquetage de la contactine, Caspr, Kv1.1, ankyrin G ou Nav canaux (données non présentées), suggérant que l'absence de Kv3.1 n'altère pas l'organisation de ces protéines axonales dans les fibres myélinisées.

Distribution et interaction avec l'ankyrine G des sous-unités Kv3.1b et Kv3.2. UN B, Les protéines membranaires (100 μg) provenant de cerveaux de souris et de rats déficients en Kv3.1, de moelle épinière, de nerf optique et de nerf sciatique ont été fractionnées dans du gel SDS et soumises à un immunotransfert pour Kv3.1b (UNE) et Kv3.2 (B). Kv3.1b a été exprimé dans le cerveau et la moelle épinière du rat, et dans une moindre mesure dans le nerf optique. Aucune bande n'a été observée chez la souris déficiente en Kv3.1. Kv3.2 a été détecté dans le cerveau de souris et de rat et dans une moindre mesure dans la moelle épinière de rat. C, Les membranes du cerveau et de la moelle épinière (200 μg) ont été immunoprécipitées séparément pour Kv3.1b ou Kv3.2 puis immunoblottées pour Kv3.1b. Notez que Kv3.1b co-immunoprécipite abondamment avec Kv3.2 dans le cerveau mais pas dans la moelle épinière. D, ELes membranes du cerveau et de la moelle épinière (200 μg) ont été immunoprécipitées avec des anticorps de lapin anti-ankyrine G (Ank-G), de lapin anti-Kv3.1b, de lapin anti-Kv3.2 ou de souris anti-Kv1.2, puis immunoblot pour Kv3.1b () ou ankyrine G (E). La membrane cérébrale (BM) a été utilisée comme contrôle positif. Kv3.1b co-immunoprécipite avec l'ankyrine G et Kv3.2, mais pas Kv1.2 (). Une isoforme de faible poids moléculaire de l'ankyrine G a été réduite avec Kv3.1b, mais pas avec Kv3.2 ou Kv1.2 (E). Les marqueurs de poids moléculaire sont affichés à droite en kilodaltons.

Étant donné que les sous-unités des canaux K + voltage-dépendants peuvent former des canaux hétéromères avec des membres de leur propre famille (Kv1, Kv2, Kv3 et Kv4), nous avons immunoprécipité Kv3.2 pour déterminer si les sous-unités Kv3.1b et Kv3.2 pouvaient interagir. Lorsque Kv3.2 a été précipité, il a entraîné plus de Kv3.1b dans le cerveau que dans la moelle épinière (Fig. 9C ), en accord avec le manque relatif de Kv3.2 dans la moelle épinière. Ces résultats indiquent que Kv3.1b pourrait spécifiquement former des canaux hétéromères avec Kv3.2 dans le SNC, mais s'ils le font, ce n'est pas au niveau des nœuds.

Pour déterminer si l'ankyrine G interagit avec Kv3.1b, les membranes du SNC ont été incubées avec des antisérums contre l'ankyrine G ou Kv3.1b, et les immunoprécipités ont été sondés pour les mêmes protéines. Nous avons utilisé des immunoprécipités pour Kv3.2 comme contrôle positif et des immunoprécipités pour Kv1.2 comme contrôle négatif. Lorsque l'ankyrine G a été précipitée des membranes cérébrales, elle a fait baisser Kv3.1b (Fig. 9 ). Cependant, Kv3.1b n'a pas réduit les isoformes de haut poids moléculaire de l'ankyrine G, mais a réduit une isoforme de l'ankyrine G de � kDa (Fig. 9E ). Ni Kv3.2 ni Kv1.2 n'ont co-immunoprécipité cette isoforme de l'ankyrine G ( Fig. 9E ). L'ankyrine G étant sensible à la protéolyse (Davis et Bennett, 1984), cette isoforme pourrait correspondre à un produit de dégradation des isoformes nodales de haut poids moléculaire de l'ankyrine G. Alternativement, ce résultat pourrait indiquer qu'une isoforme de l'ankyrine G qui est non localisé aux nœuds interagit avec Kv3.1b, car l'ankyrine G et le Kv3.1b sont tous deux présents dans la matière grise.

Kv3.1b participe-t-il à la repolarisation AP dans les nœuds du SNC ?

Pour répondre à cette question, nous avons testé les effets du 4-AP, un puissant bloqueur de Kv3.1b (Grissmer et al., 1994), sur les CAP enregistrées à partir du nerf sciatique, du funicule ventral de la moelle épinière et du nerf optique de rats adultes. 4-AP a légèrement augmenté la durée des PAC des nerfs sciatiques ( Fig. 10UNE ), mais élargi les CAP enregistrées à partir du funicule ventral de la moelle épinière et du nerf optique ( Fig. 10UNE ). L'absence d'effet de la 4-AP dans le SNP pourrait être attribuable à la faible expression de Kv3.1b dans le nerf sciatique, mais la 4-AP a affecté le nerf optique, dans lequel peu de ganglions étaient Kv3.1b-positifs. Pour résoudre cet écart, nous avons enregistré les CAP des nerfs optiques de souris WT déficientes en Kv3.1 et du même âge. Les CAP enregistrées sur des souris déficientes en WT et en Kv3.1 avaient des débuts, des pics et une durée similaires (Fig. 10B ). Le recrutement et la période réfractaire des fibres étaient également similaires (données non présentées). Moreover, 4-AP broadened the CAPs from both the WT and the mutant mice ( Fig. 10B ). These results suggest that the effects of 4-AP in the optic nerve axons are not mediated by Kv3.1 another nodal K + channel subunit could mediate these effects.

Effects of 4-AP on the CAPs of rat sciatic nerves, spinal cord ventral funiculi and optic nerves, as well as WT and Kv3.1-deficient mouse optic nerves. UNE, 4-AP (500 μ m ) increased slightly the duration of the CAPs from rat sciatic nerves (top traces, m = 2), but prolonged greatly the CAPs from the ventral funiculus (middle traces, m = 5) and optic nerve (bottom traces, m = 6).B, In WT (m = 2) and Kv3.1-deficient mice (m = 2), the characteristics of the optic nerve CAPs were identical, and 4-AP had similar effects.


Revoir

"This atlas provides an excellent, detailed map of the entire spinal cord of both rat and mouse. The photomicrographs are outstanding, the labelling is clear and the illustrations should serve as outstanding examples of what high quality staining and immunocytochemistry should look like. This information has not been available in any atlas of the CNS before, and will be an extremely useful resource for all neuroscientist interested in this part of the nervous system and a 'must-have' for spinal cord labs." --Jacqueline C. Bresnahan, Professor, Department of Neurological Surgery, Brain and Spinal Injury Center, University of California at San Francisco, USA

"The Spinal Cord is an authoritative and detailed account of the development, organization and function of the spinal cord. Written by a series of experts, the book contains enlightening chapters that cover the anatomy and the architecture of the spinal cord in a clear and logical fashion. Attention to special topics, such as spinal cord injury and micturition, is unprecedented and unusually informative. The comprehensive atlas, along with the diagrams and list of references, will be of considerable use to the students of the nervous system, as well as the most senior of investigators. It is an excellent volume!" --Moses V. Chao, Professor of Cell Biology, Physiology and Neuroscience and Psychiatry, Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU School of Medicine, New York, USA

A propos de l'auteur

Charles Watson is a neuroscientist and public health physician. His qualifications included a medical degree (MBBS) and two research doctorates (MD and DSc). He is Professor Emeritus at Curtin University, and holds adjunct professorial research positions at the University of New South Wales, the University of Queensland, and the University of Western Australia.
He has published over 100 refereed journal articles and 40 book chapters, and has co-authored over 25 books on brain and spinal cord anatomy. The Paxinos Watson rat brain atlas has been cited over 80,000 times. His current research is focused on the comparative anatomy of the hippocampus and the claustrum.
He was awarded the degree of Doctor of Science by the University of Sydney in 2012 and received the Distinguished Achievement Award of the Australasian Society for Neuroscience in 2018.

Professor George Paxinos, AO (BA, MA, PhD, DSc) completed his BA at The University of California at Berkeley, his PhD at McGill University, and spent a postdoctoral year at Yale University. He is the author of almost 50 books on the structure of the brain of humans and experimental animals, including The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, now in its 7th Edition, which is ranked by Thomson ISI as one of the 50 most cited items in the Web of Science. Dr. Paxinos paved the way for future neuroscience research by being the first to produce a three-dimensional (stereotaxic) framework for placement of electrodes and injections in the brain of experimental animals, which is now used as an international standard. He was a member of the first International Consortium for Brain Mapping, a UCLA based consortium that received the top ranking and was funded by the NIMH led Human Brain Project. Dr. Paxinos has been honored with more than nine distinguished awards throughout his years of research, including: The Warner Brown Memorial Prize (University of California at Berkeley, 1968), The Walter Burfitt Prize (1992), The Award for Excellence in Publishing in Medical Science (Assoc Amer Publishers, 1999), The Ramaciotti Medal for Excellence in Biomedical Research (2001), The Alexander von Humbolt Foundation Prize (Germany 2004), and more.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Animaux. Twenty-nine adult female cats (8 intact and 21 spinal cord-transected) were used in the present experiments (Table1). Cats that had undergone complete low-thoracic spinal cord transection were maintained for 3–25 months.

Summary of postoperative training status and tissue analysis procedures

Spinal cord transection. During all surgical procedures, sodium pentobarbital (35 mg/kg, i.p.) was administered to each cat after pretreatment with atropine sulfate (0.9 mg/kg, s.c.) and acepromazine maleate (10 mg/kg, i.m.). Supplemental doses of the anesthetic were administered as needed during surgery to maintain a low level of arousal.

The spinal cords of the cats were transected completely as described previously (Roy et al., 1992). Briefly, a skin incision was made on the back to expose the vertebral processes between T10 and L1. A partial laminectomy was performed to expose the spinal cord between T11 and T13. Fine scissors were used to open the dura and to transect the bulk of the spinal cord. Fine forceps and miniature cotton balls were used to complete the transection while preserving the ventral artery. The completeness of the transection was easily verified as the spinal cord retracted at both ends, leaving a 3–5 mm space. Gelfoam was inserted between the two ends the area was thoroughly flushed with saline and the muscle and skin above the lesion site were closed with sutures. Postspinalization management of the spinal cats was performed as described previously (Roy et al., 1992). After all surgical procedures, the animals were placed in a warm incubator and allowed 1 d of recovery before they were returned to their cages.

Antibiotics were administered twice daily to each animal for 1 week after surgery. The cats were housed in spacious cages, two to four cats per cage. After spinal cord transection, the cage floors were covered with shredded newspaper, and the bladders and colons of the cats were expressed daily. Dry kibble and water were given ad libitum, and wet food was given once daily. All procedures were performed in accordance with the following guidelines: care and use of laboratory animals prepared by the Institute of Laboratory Animal Resources for the National Institutes of Health, the American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care, and the Chancellor's Animal Research Committee at the University of California, Los Angeles.

Implantation of electromyographic electrodes. Approximately 2 months before spinal cord transection, electromyographic (EMG) wires were implanted into selected flexor and extensor muscles of the hindlimbs of some cats (soleus, medial gastrocnemius, tibialis anterior, semitendinosus, vastus lateralis, gluteus medius, and iliopsoas) as described by Pierotti et al. (1989). EMG and video recordings during treadmill locomotion were initiated after 1 week of recovery and continued for the full duration of the study. EMG activity during stepping and standing was recorded periodically in animals that had undergone multiple training paradigms i.e., some cats were trained to stand and then to step and vice versa. All data presented were taken during the last training mode as shown in Table 1.

Hindlimb training and testing procedures. The training and testing procedures have been described in detail previously (de Leon et al., 1998a,b). Briefly, a cloth harness was fitted over the shoulders, between the forelimbs, and around the upper trunk. The forelimbs of the cats rested on a platform raised ∼2.5 cm above the training surface during all training and testing procedures. After spinalization, training of bipedal hindlimb stepping or standing was performed for 30 min/d, 5 d/week (for details, see de Leon et al., 1998a,b). Stepping ability during a locomotor test was measured by counting the number of plantar steps, i.e., the number of full weight-bearing steps executed on the soles of the paws in the two hindlimbs at a speed of 0.4 m/sec during a 45 sec trial. Full weight-bearing steps occurring on the dorsum of the paw were not included in the plantar step number. To train full weight-bearing bilateral hindlimb standing, the hindpaws were placed on the plantar surfaces, and the skin around the knee or ankle was patted lightly or pinched to elicit extensor reflexes. These stimuli were not used to maintain standing but were delivered when necessary to reinstate standing when the hindlimbs collapsed to a sitting, non-weight-bearing position. To train unilateral standing, weight bearing was allowed in only one hindlimb (trained limb) while the other limb (nontrained limb) was held above the training surface (de Leon et al., 1998b). The trainers held the tail only to provide lateral support during standing. To maintain lateral stability during unilateral standing, it was necessary to shift the weight of the hindquarters onto the trained limb. Typically, the trainers held the paw of the nontrained limb and moved it posteriorly and dorsally to near the base of the tail, resulting in the hindquarters leaning toward the weight-bearing limb. To evaluate standing ability after spinalization, weight bearing in one or both hindlimbs was initiated using the same stimuli that were used during training. After a weight-bearing posture was attained, the initiating stimuli were avoided, allowing the hindlimbs to stand until they collapsed to a sitting, non-weight-bearing position. Several bouts of standing were initiated to ensure a consistent performance.

EMG and kinematic data during stepping were recorded as described by de Leon et al. (1994). Briefly, raw EMG signals were amplified and recorded on a frequency modulation (FM) tape recorder (XR-510 TEAC Corp., Montebello, CA), and a camera and videocassette recorder (WV D5100 camera and AG1280P recorder Panasonic, Cypress, CA) were used to record the video signals. A Society of Motion Picture and TV Engineers time code generator (F30, Fast Forward Video, Irvine, CA) was used to synchronize video frames with the EMG signals recorded on FM tape. The EMG signals from each muscle during 10–45 sec bouts of stepping or standing were sampled into an Amiga computer at 2 kHz (de Leon et al., 1998a,b, 1999).

Tissue processing. Both intact (m = 4) and spinal cord-transected (m = 14) cats (except those used for immunoblot analysis) were perfused intracardially with 4% formaldehyde in 0.12 m phosphate buffer. The entire spinal cord, including the transection site, was removed, post-fixed in the fixative solution for 2 hr, and washed with 0.12 m phosphate buffer (four times, 30 min each). The cords then were transferred to 30% sucrose for 2 d, embedded on OCT-Tissue Tek (Miles, Elkhart, IN), and frozen on dry ice. Tissues were stored at −70°C until analysis.

Transverse sections (30 μm thick) of fixed spinal cords (L5–L7) were cut using a cryostat and collected free-floating in PBS. After washing in PBS, adjacent sections were processed for immunohistochemistry,in situ hybridization, or histochemical staining. The tissue sections used to compare the experimental groups were processed simultaneously. To minimize tissue damage that may occur with tissue handling, we processed free-floating sections using a netwell setup (75 μm mesh Costar, Cambridge, MA). Spinal cord sections in netwells were transferred sequentially to netwell trays containing appropriate solutions. Incubation with cRNA probes, antibodies, and ribonuclease A (Sigma, St. Louis, MO) and color reactions were performed in 24-well plates.

The lesion sites from each cat were evaluated for completeness of the transection by histological analysis of 20 μm sagittal sections (thawed on slides) with luxol blue (myelin) and cresyl violet (neurons and glia) stains (Kluver and Barrera, 1953).

Immunohistochimie. Sections were processed for immunohistochemistry using an avidin–biotin complex (ABC)-peroxidase system (ABC Elite Vector Laboratories, Burlingame, CA) as described previously (Esclapez et al., 1994 Tillakaratne et al., 2000). Sections from spinal cord segments L5–L7 from control and spinal cats were incubated in 1:3000 or 1:4000 dilutions of K2 polyclonal antibody, which mainly recognizes GAD67 (Kaufman et al., 1991). The monoclonal antibody GAD6, which specifically recognizes GAD65, was used at a 1:100 dilution (Chan and Gottlieb, 1988 Erlander et al., 1991). To optimize cell body staining, we did not use detergents in the procedure. The sections were first rinsed in 0.02 m m potassium PBS (KPBS in m m : 16.5 K2HPO4, 3.5 KH2Bon de commande4, and 150 NaCl) for 30 min and then incubated with 3% normal serum (NS) diluted in KPBS for 1 hr (blocking step), followed by incubation with the antibody diluted in 1% NS for 16–20 hr at room temperature. Normal goat serum and normal horse serum (Vector Laboratories) were used for GAD67 and GAD65, respectivement. Sections were rinsed three times, followed by two 10 min washes in KPBS. Sections then were incubated with the biotinylated secondary antibody (1:200 in 1% NS) for 1 hr. Sections were washed and incubated in avidin–biotin complex (A and B reagents at 1:100 in KPBS) for 1 hr. The sections were washed and reacted with the DAB and H2O2 (Sigma). Color development was monitored and ranged from 10 to 13 min. The time of the color development within an experiment was held constant. The sections were washed and mounted on superfrost slides (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), air-dried, and coverslipped with cytoseal (Stephens Scientific). Washings after primary, secondary, and ABC immunohistochemistry and color development were performed as described above.

In situ hybridation. Antisense and sense cRNA GAD67 probes were transcribed from subclones 13 and 16 of feline BamHI-linearized GAD67 cDNA using Sp6 RNA polymerase and digoxigenin-11-UTP (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) (Kaufman et al., 1986 Wuenschell et al., 1986 Tillakaratne et al., 2000). Digoxigenin-labeled RNA probes were partially digested with alkali to fragments 150–500 bases long, and their concentrations were measured as described previously (Esclapez et al., 1993, 1994Tillakaratne et al., 2000). Sections were hybridized with digoxigenin-labeled cRNA (0.2 ng/ml) for ∼16 hr at 50°C and washed as described previously (Esclapez et al., 1993, Tillakaratne et al., 2000). The hybrids were detected immunologically by incubation with alkaline phosphatase-conjugated digoxigenin antibody (Roche Molecular Biochemicals) followed by nitroblue tetrazolium chloride–5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate color development.

Immunoblots. L5 and L6 segments of unfixed spinal cords (four intact, four nontrained, and three step-trained spinal cord-transected cats whose spinal cords were transected 12 months earlier see Table 1) were cut into lengths of ∼3–4 mm and sonicated in homogenization buffer (100 mg tissue/ml Tillakaratne et al., 2000). The homogenization buffer consisted of 60 m m phosphate buffer, pH 7.4, 1 m m phenylmethylsulfonyl fluoride, and 0.5% Triton X-100. The homogenates were centrifuged for 15 min at 100,000 × g using a TL100 ultracentrifuge (Beckman Instruments, Palo Alto, CA), and the total protein in the supernatants was measured by the Bradford assay (Bio-Rad, Hercules, CA). For immunoblot analyses, proteins (30 μg) were separated by SDS-PAGE.

Ten 50-μm-thick L6 spinal cord transverse sections were pooled to make the protein homogenates for slot blot quantification. Spinal cord homogenates were loaded into the wells of a slot blot apparatus (Schleicher & Schuell, Keene, NH). After blotting onto nitrocellulose membranes, we detected GAD67 and β-tubulin proteins by enhanced chemiluminescence (ECL Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL). We determined the dilutions of the primary and secondary antibodies that yielded consistent quantitative results. Blots were incubated overnight at 4°C with K2 (anti-GAD67 at 1:3000) or anti-β tubulin at 1:3000 (Chemicon, Temecula, CA) after blocking for 1 hr at room temperature with 10% nonfat milk in PBS containing 0.1% Tween 20 (PBST). After washing with PBST, the blots were incubated with the appropriate secondary antibody (1:2000) for 1 hr at room temperature. Antibody dilutions were made in PBST containing 5% nonfat milk. Washing between incubations consisted of three quick rinses, one 15 min rinse, and four 5 min rinses in PBST. Signals were visualized by ECL and exposure to x-ray film. The films then were scanned using an image analysis system (C-Imaging Compix Inc., Cranberry Township, PA) to determine the optical density of the protein bands. This protocol gives a linear standard curve using bacterially produced GAD67. Using total protein concentrations that were in the linear range of ECL detection (50–15 μg), we compared GAD67 levels after correcting for differences in loading and transfer by normalizing to β-tubulin in the same blots (Tillakaratne et al., 2000). It was possible to use the same blots two or three times with the same limits of immunodetection.

Microscopic analysis. The uniformity of tissue processing is a critical factor when analyzing the staining patterns and intensity between animals. Thus, primary fixation, post-fixation, and tissue processing were similar for the spinal cord sections prepared for immunohistochemistry or for in situ hybridation. The cat cerebellum was used as a positive control for immunohistochemistry and for in situ hybridation. The specificity of the GAD immunostaining was confirmed by the presence of GAD-immunoreactive neurons and punctate structures in the cerebellar cortex (Esclapez et al., 1993, 1994). Specificity also was confirmed by the lack of staining in tissue sections that had been incubated without the primary antibody or with the sense cRNA probe. Spinal cord transverse sections of the L5–L7 segments of intact and spinal cord-transected cats to be compared were run concurrently either for immunohistochemistry or forin situ hybridation. The time of color development within an experiment was held constant. Adjacent spinal cord sections processed for GAD67 and GAD65 were examined for the differential immunostaining reported for GAD67 but not for GAD65 after spinal cord transection (Tillakaratne et al., 2000). Cresyl violet and luxol blue staining of sections was used to evaluate the number and size of neurons.

Spinal cord sections of control and spinally transected cats, processed concurrently, were used for qualitative and semiquantitative analyses. Images to be compared were acquired with a Zeiss (Thornwood, NY) Axiophot microscope equipped with a Sony-3 CCD color camera under identical conditions (magnification, light levels, and other microscopic settings), and saved as tagged image file format files. The images were analyzed by C-Imaging software (Compix). Work files were customized for each measurement. Threshold values were set to discriminate the signal from the background. The identified objects were viewed as a green binary overlay displayed over the original image. Measurements included the staining intensity of GAD67 immunoreactivity in the lateral ventral horn of individual neurons in lamina IX and of GAD67 mRNA in individual neurons of medial and lateral laminas V and VI and the medial and lateral ventral horns. Regions of interest (ROIs subregions or individual neurons) for optical density measurements were outlined manually on the saved images. Pixels outside the ROIs were removed using the qualify feature. We added the edit option on the work file to erase, redraw, or individually remove obvious background spots before the final data acquisition. The zoom and roam feature was used on the image on display for detailed examination. The customized work files were saved and loaded to collect data from the saved images and the data were copied to Excel spreadsheets (Microsoft, Redmond, WA) and analyzed statistically. The cross-sectional areas of individual neurons were measured, and the optical density of staining was measured as the total object area. The total object area then was calculated with respect to the area of the ROI.

TAG67-positive neurons in medial lamina IX were captured at 250× at identical illumination. For the optical density measurements, individual neurons (a total of 120 neurons per cat) were outlined manually. The optical density of staining was measured as the total object area inside the outlined area (ROI). The mean GAD67 immunostaining in lamina IX in control and experimental animals (except in the unilaterally stand-trained cats) was calculated using 120 lamina IX neurons from each animal. The distribution and analysis of GAD67 immunostaining in unilaterally stand-trained cats were determined from 25 sequential transverse sections (30 μm thick, each taken at ∼120 μm) of the L5–L7 spinal segments processed for GAD67. We first compared the total object area in all of the GAD67 neurons in the contralateral and ipsilateral lamina IX region. For detailed analysis, individual GAD67-positive neurons in lamina IX of 25 sections were captured at 500× at identical illumination. The amount of GAD67 staining in individual neurons on the ipsilateral and contralateral sides (a total of 464 neurons) was measured as described above. The mean immunoreactivity per neuron between the trained and nontrained sides was compared usingt tests. The number of positively stained cells was divided into four groups using the labeling intensity values (strongest, 1.00–0.80 strong, 0.79–0.60 medium, 0.59–0.40 and low, <0.39). These values were used to add pseudocolors to neurons in the three-dimensional (3-D) representation of the GAD67 staining (see Fig. 5 also see below). We used the χ 2 test to determine whether the frequencies of cells in each intensity range were significantly different between the contralateral and ipsilateral sides (see Fig.5).

The amount of GAD67 mRNA levels in individual neurons in the medial and lateral areas of laminas V and VI and the ventral horn (from eight sections) were measured as described above. Differences in the mean immunoreactivity per neuron among the four groups were compared using the mixed model (see below). Positively stained cells were subdivided into two groups using the labeling intensity values (high, ≥0.3 and low, <0.3). We used the χ 2 test to determine whether the frequencies of cells in the intensity ranges were significantly different among the four groups (see Fig. 9).

3-D reconstruction of GAD67-immunoreactive neurons. Sequential (1:4 series) transverse spinal cord sections (30 μm thick) of the L5–L7 segments of the unilaterally stand-trained cats were processed for GAD67(1:3000, K2 antibody), GAD65 (1:100, GAD6), or cresyl violet staining. The spinal cord sections with GAD67 staining were analyzed at 31× magnification to capture the entire right or left half of the spinal cord. Overlapping images of these sections were used in Figure 4.

To make a 3-D reconstruction, we used 6 of the 25 spinal cord sections processed for immunohistochemistry (see above). The actual positions of the GAD67-positive neurons in each section were copied to separate transparencies. A digitizing program was used to incorporate X, oui, et z coordinates of the GAD67-positive neurons. The position of these neurons and the corresponding optical density and size measurements then were used to construct a 3-D image of the GAD67 immunostaining with the 3-D-Studio Max program (Kinetix).

Statistical analyses. Computer-based resampling (“bootstrap”) software (version 4.0.2 Resampling Stats, Arlington, VA) and a mixed model were used to determine differences in group means (intact vs spinal, intact vs trained, and trained vs nontrained) as described previously (Efron and Tibshirani, 1993 de Leon et al., 1998a,b). A mixed model was used to study the differences in GAD67 staining among the experimental groups. The model used was: Ouiijg =je + βg, oùOuiijg is the jth measurement of GAD67 staining for subject je in group g,je is the intercept for subject je, etg is the effect of group g (Efron and Tibshirani, 1993 Tillakaratne et al., 2000). The significance level was set at p < 0.05.


Evidence that 4S RNA is axonally transported in normal and regenerating rat sciatic nerves

Studies in regenerating goldfish optic nerves indicate that RNA may be axonally transported during optic nerve regeneration 14, 18, 19 . The present study was performed to determine if the axonal migration of RNA could be demonstrated during regeneration of the rat sciatic nerve.

Rats, which had only the left sciatic nerve crushed 10 days earlier, were injected bilaterally with [ 3 H]uridine into the spinal cord at segmental levels L5 and L6, thus labeling ventral horn cells giving rise to the sciatic nerve. Six, 14 and 20 days later rats were sacrificed by cardiac perfusion of saline followed by 10% formaldehyde. Formaldehyde-precipitable radioactivity, identified as [ 3 H]RNA, was 4–5 times greater in the regenerating sciatic nerve compared to the normal nerve and moved without impediment beyond the point of the crush into the regenerating portion of the nerve.

The axonal migration of free unincorporated labeled RNA precursors was also demonstrated, raising the possibility that the distribution of [ 3 H]RNA along the sciatic nerve might be entirely extra-axonal i.e., free [ 3 H]uridine is taken up by Schwann cells from the axon where it is incorporated into [ 3 H]RNA. This interpretation of the data would also result in the appearance of a proximodistal distribution of RNA associated radioactivity. To determine whether any sciatic nerve [ 3 H]RNA was due to axonal transport, rats which had only the left sciatic nerve crushed 10 days earlier were injected bilaterally with [ 3 H]uridine into the spinal cord. Fourteen days after injection, rats were sacrificed and radioactivity present in the nerve was confirmed as RNA by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Radioactivity in the various RNA species 14 days after intraspinal injection showed the following distribution: 28 + 18S RNA — normal39.3%±2.1 regenerating45.4%±1.6 4S RNA — normal43.0%±1.3 regenerating46.8%±2.7. Similar characterization of sciatic nerve RNA 1 or 3 days following the intravenous administration of [ 3 H]uridine gave the following distribution: 28 + 18S RNA — normal72.4%±3.0 regenerating75.0%±3.6 4S RNA — normal7.7%±1.3 regenerating10.7%±0.8.

The intraspinal injection of [ 3 H]uridine would label Schwann cell RNA and, in addition, any species of intra-axonal RNA, while intravenous injections would label Schwann cell RNA and not axonal RNA. If 4S RNA is in the axon, one would predict relatively more labeled 4S RNA following intraspinal injections than following intravenous injections. The data demonstrate an enrichment of 4S RNA in both normal and regenerating rat sciatic nerve following the intraspinal but not following the intravenous injection of labeled precursor. Therefore, we suggest that 4S RNA migrates axonally in both normal and regenerating sciatic nerves of rats.


Why Does Cauda Equina Syndrome Affect Everyone Differently?

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Post by Lαrα on Jan 25, 2014 4:53:45 GMT -8

Hey Guys..I know that when i first was given the news that I had Cauda Equina Syndrome I had no understanding of why this affected me in the way it does.
I can remember asking my physio to explain to me why some parts of my lower extremities had sensation more that others and why some muscles were weaker than others. why is my bladder, bowel and sexual function affected?

She explained a little but to be honest, not in a way that made enough sense to me. I searched for more understanding. from questioning and researching, gradually my understanding built up but i am always looking for more understanding and clarification.

So why does Cauda Equina Syndrome affect each of us differently?

Cauda Equina Syndrome commonly causes weakness and sensory loss to the lower limbs, the 'saddle area' and significantly affects the bladder, bowel and sexual function.

The symptoms and signs vary depending on the rate and extent of the compression, the size of the spinal canal, and the number of nerve roots involved. Because the sacral roots lie closest to the midline in the cauda equina, they bear the most damage.

A large central disc herniation, for example, would cause significant damage and symptoms including severe pain which is often worse at night.

The diagram below shows the "horse tail" that is often referred to in Cauda Equina Syndrome.This is in reference to spinal nerves within the vertebral canal. After the spinal cord tapers out, the spinal nerves continue as dangling nerve roots called cauda equina.

You will see on the diagram an aqua blue arrow that is pointing to a line that runs across the spinal nerves. This is representing an area that is compressed across the nerves. There is a black faint line above the arrow, this is showing the area the disc would be. It is situated in between L3/L4 vertebrae. Therefor the nerves below that are affected are those at the point of compression. As you can see several nerve roots are affected.

A factor in severity of longterm symptoms will depend on several factors. As many of us are aware, in the case of Cauda Equina Syndrome early intervention is crucial at the onset of symptoms.

Take a look at the illustration below..It shows which nerve roots affect the lower extremities. It will also explain why for many of us different muscles are affected more than others and why altered sensation differs in different areas.

For myself. my damage was at the point of L4/L5 disc so at the areas shown below on L3 are unaffected for me.
Sensation is affected everywhere except the for the 'strip' down the front of my legs where it is relevantly normal. My left leg is weaker then my right leg which will indicate that the nerves to this leg had more significant compression.

This video, although graphic, explains very clearly what happens at the point of compression and why we are affected differently. its a must watch!

Butiki
Advanced Member



Voir la vidéo: Neuroanatomie - La moelle épinière (Janvier 2022).