Informations

Pourquoi ré-étiqueter les extrémités du brin dans un marquage ADN 3' ?

Pourquoi ré-étiqueter les extrémités du brin dans un marquage ADN 3' ?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

J'ai un problème avec une question de biologie moléculaire ; Je ne comprends pas comment fonctionne le marquage ADN 3'. J'ai pris un schéma de ma leçon et j'ai essayé de comprendre avec ; c'est ce que j'ai compris. Si je me trompe, merci de me le dire et de me corriger.

  • On prend une enzyme de restriction qui va couper les deux brins. Le brin inférieur sera une extrémité de 5'. Ainsi, le brin supérieur est plus court que le brin inférieur.

  • On ajoutera un fragment de Klenow qui, avec son activité polymérase, polymérise dans le sens 5'->3' la partie manquante du brin supérieur, avec dNTP α 32P (marqué par un phosphate radioactif en position alpha).

  • On obtient deux brins qui ont la même taille, dont l'un sera fortement marqué.

  • On termine avec une transférase terminale qui va catalyser l'ajout de dNTP α 32P sur les extrémités 3'OH des deux brins d'ADN (afin de marquer ces extrémités).

Mais, si j'ai raison, pourriez-vous expliquer la nécessité de la dernière étape ; pourquoi étiqueter les deux extrémités puisque nous avons déjà étiqueté le brin supérieur ?


Il existe de nombreuses façons de marquer les acides nucléiques pour les sondes (Résumé des méthodes).

Bien qu'il existe des cas où le remplissage médié par le fragment de Klenow devrait suffisamment marquer les deux brins de votre sonde, il y en a beaucoup d'autres où cela ne serait pas suffisant. Voici deux exemples illustratifs, quoique quelque peu artificiels :

Exemple 1 : Double digest avec surplombs de 5' et 3'
Imaginez que vous ayez fait un double résumé avec BamBonjour et KpnI pour libérer votre séquence sonde du plasmide dans lequel vous propagez la séquence. BamHI vous donnera un surplomb de 5', mais KpnJe donne un surplomb de 3'.

Résultat BamSALUT & KpnI fragment de digestion double : 5'- GATCCNNNNNNNG - 3' ||||||||| 3'- GNNNNNNNNCCATG - 5'

Traitement ultérieur avec le fragment de Klenow + $alpha$P32-dATP + dNTP froids rempliront à la fois le surplomb 5' (activité polymérase 5'->3' de Klenow) et élimineront le surplomb 3' (activité exonucléase 3'->5' de Klenow).

Réaction post-Klenow (en gras = nouvelles bases, * = nucléotide radiomarqué) : 5'- GATCCNNNNNNNG - 3' ||||||||||||| 3'- CTAGGNNNNNNNNC - 5' *

À ce stade, un seul brin est radiomarqué, de sorte que l'étape de transférase terminale est nécessaire pour ajouter un marqueur au brin supérieur.

Lors de l'utilisation de $alpha$P32-dNTPs, vous choisissez souvent une seule base à être radioactive (par exemple dATP comme ci-dessus). Parfois, vous ne faites qu'augmenter la réaction avec du dNTP radioactif, laissant une population de dNTP froids à utiliser la plupart du temps. Dans les deux cas, vous avez maintenant la possibilité de ne pas incorporer uniquement des bases non radioactives.

Exemple 2 : réaction de remplissage qui n'intègre pas $alpha$P32-dATP :

Imaginez un condensé avec PspJe et veux remplir les surplombs de 5' en utilisant $alpha$P32-dATP + dNTP froids. PspJe reconnais les séquences CCWGG où W est soit A soit T afin que certains remplissages incorporent le $alpha$P32-dATP, mais pas d'autres.

Résumés possibles et réactions de remplissage : 5'- CCTGGNNNNNNNNNNCCTGG - 3' ||||||||||||||||||||| 3'- GGACCNNNNNNNNNNNNGGACC - 5' | Digérer avec Pspje | V 5'- CCTGGNNNNNNNNNN - 3' |||||||||| 3'- NNNNNNNNNNGGACC - 5' | Remplissage avec Klenow + dATP chaud + dNTP froid | V 5'- CCTGGNNNNNNNNNNCCTGG - 3' |||||||||||||||||||| 3'- GGACCNNNNNNNNNNGGACC - 5' *

Encore une fois, il ne vous reste qu'un seul brin marqué (ou aucun étiquetage de brin si la séquence était 5'-CCAGGNNNNNNCCTGG - 3') et un besoin de l'étape de transférase terminale.


Pourquoi y a-t-il un brin avant et arrière pendant la réplication de l'ADN

L'ADN double brin est d'abord décompressé par une enzyme appelée hélicase. L'hélicase sépare les deux brins d'ADN et crée la fourche de réplication. Essentiellement, deux chaînes d'ADN simple brin sont créées, toutes deux orientées dans des directions différentes. Sur le brin principal, une amorce d'ARN est créée par l'ARN polymérase et l'ADN polymérase III construira en continu ce brin, car elle construit la chaîne d'ADN dans la même direction que l'hélicase décompresse l'ADN. Sur le brin en retard, l'ADN plymérase se déplace dans la direction opposée à celle de l'hélicase, elle ne peut donc copier qu'une petite longueur d'ADN à la fois. En raison des directions différentes dans lesquelles les deux enzymes se déplacent sur le brin retardé, la chaîne d'ADN n'est synthétisée que par petits fragments. C'est pourquoi on l'appelle le brin retardé.


Question : 3. Étant donné le morceau d'ADN suivant, dessinez le brin complémentaire. Etiquette 5&x27 et 3" aux extrémités. 5'- ATG CTACCCTGCATG CATTCCC-3' 4. Écrivez chacun des brins simples de la séquence d'ADN que vous avez ci-dessus. Sur chaque brin, dessinez une amorce d'ARN de 5 nucléotides au bon endroit. Étiquetez les extrémités 5 & 3 & 27 TA TA 7 5]braw les deux molécules d'ADN double brin après

Je ne sais pas comment faire le numéro 5


ADN : cartographie de restriction et séquençage des nucléotides

Lisez cet article pour en savoir plus sur la cartographie de restriction de l'ADN qui implique l'analyse de la taille des fragments de restriction et découvrez également le séquençage nucléotidique de l'ADN pour lequel deux techniques ont été développées :

(1) basée sur la méthode enzymatique appelée séquençage de Sanger et (2) basée sur la méthode chimique appelée séquençage de Maxam et Gilbert.

Cartographie de restriction des fragments d'ADN :

Cela implique l'analyse de la taille des fragments de restriction produits par plusieurs enzymes de restriction individuellement et en combinaison. Par exemple, sur la figure 3.2, les sites de restriction de deux enzymes A et B sont cartographiés. Le clivage avec A donne des fragments de 2 et 7 kilobases à partir d'une molécule de 9 kb, nous pouvons donc avoir la position d'un site A unique à une extrémité.

De même, B donne des fragments à 3 kb et 6 kb, donc il a un seul site à 3 kb d'une extrémité mais il n'est toujours pas clair si ce site est proche du site A&8217s ou est à l'extrémité opposée de l'ADN. Cela peut être résolu par une double digestion. Si les fragments résultants sont éloignés de 2 kb, 3 kb et 4 kb, alors A et B coupent aux extrémités opposées de la molécule s'ils sont éloignés de 1 kb, 2 kb et 6 kb, les sites sont proches l'un de l'autre. Il vaut la peine de préciser ici que la cartographie de molécules réelles est rarement aussi simple que cela.

Séquençage nucléotidique de l'ADN:

L'utilisation précise des codons, les informations concernant les mutations et les polymorphismes et l'identification des séquences de contrôle de régulation des gènes ne peuvent être élucidés qu'en analysant les séquences d'ADN. Deux techniques ont été développées pour cela, l'une basée sur une méthode enzymatique fréquemment appelée séquençage de Sanger et une méthode chimique appelée séquençage de Maxam et Gilbert.

Séquençage de Sanger ou terminateurs de chaîne didésoxynucléotide:

Dans celui-ci, le mélange réactionnel est divisé en quatre groupes, représentant les quatre dNTP A, C, G et T. En plus de tous les dNTP présents dans le tube A, un analogue de dATP est ajouté (2 & 8242, 3 & 8242 ddATP ) est ajouté qui est similaire à A mais n'a pas de groupe hydroxyle 3 & 8242 et mettra ainsi fin à la chaîne en croissance. La situation pour les autres tubes ddC, ddG et ddT est identique sauf qu'ils contiennent respectivement ddCTP, ddGTP et ddTTp.

Étant donné que l'incorporation de ddNTP plutôt que de dNTP est un événement aléatoire, la réaction produira une nouvelle molécule dont la longueur variera considérablement, mais toutes se termineront au même type de base. Ainsi, quatre ensembles de séquences d'ADN sont générés, chacun se terminant à un type de base différent, mais tous ont une extrémité 5 & 8242 commune. Les quatre échantillons marqués et à terminaison de chaîne sont ensuite dénaturés par chauffage et chargés les uns à côté des autres pour l'électrophorèse.

L'électrophorèse est réalisée à 70°C en présence d'urée, pour éviter la renaturation de l'ADN. Des gels très fins et longs sont utilisés pour une résolution maximale sur une large gamme de longueurs de fragments. Après électrophorèse, la position des bandes d'ADN radioactif sur le gel est déterminée par autoradiographie.

Étant donné que chaque bande de la piste du didésoxyadénosine triphosphate doit contenir des molécules qui se terminent à l'adénine, et celles du ddCTP se terminent à la cytosine, etc., il est possible de lire la séquence du brin nouvellement synthétisé à partir de l'autoradiographie, à condition que le gel puisse résoudre les différences. de longueur égale à un seul nucléotide. Dans des conditions idéales, des séquences jusqu'à environ 400 bases de longueur peuvent être lues à partir d'un gel.

Séquençage PCR direct:

Il est possible d'effectuer un séquençage de nucléotides à partir de molécules double brin telles que des vecteurs de clonage plasmidiques et des produits de PCR, mais l'ADN double brin doit être dénaturé avant l'annelage avec l'amorce. Dans le cas des plasmides, une étape de dénaturation alcaline est suffisante. Cependant, pour les produits PCR, cela est plus problématique et fait l'objet de nombreuses recherches. Contrairement aux plasmides, les produits PCR sont courts et recuits rapidement, empêchant ainsi le processus de re-annelage ou biaisant l'amplification vers un brin en utilisant un rapport d'amorce de 100:1 peut surmonter ce problème dans une certaine mesure.

Des dénaturants tels que l'amide de forme ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) sont généralement utilisés pour empêcher la renaturation des brins de PCR après leur séparation, il est possible de séparer physiquement et de conserver un brin de PCR en incorporant une molécule telle que la biotine dans l'une des amorces, qui peut être récupérée après PCR par chromatographie d'affinité avec la streptavidine, laissant le brin PCR complémentaire. Ainsi, il a fourni un ADN simple brin de haute qualité pour le séquençage.

L'une des méthodes les plus utiles de séquençage des produits PCR est appelée séquençage du cycle PCR. Il ne s'agit pas à proprement parler d'une PCR, car elle implique une amplification linéaire avec une seule amorce en environ 20 cycles de PCR. Des didésoxynucléotides radiomarqués ou marqués par fluorescence sont ensuite introduits dans les étapes finales de réaction pour générer des produits d'extension de terminaison de chaîne. Le séquençage PCR direct automatisé est de plus en plus perfectionné, permettant d'analyser de plus grandes longueurs d'ADN en un seul cycle de séquençage.

Séquençage d'ADN fluorescent automatisé:

Cela implique des didésoxynucléotides marqués avec différents fluorochromes et sont utilisés pour effectuer la terminaison de chaîne comme dans les réactions standard. L'avantage de cette modification est que, comme un label différent est incorporé dans chaque ddNTP, tous les produits sont passés sur le même gel d'électrophorèse dénaturante.

Chaque produit avec son colorant spécifique de base est excité par un laser et le colorant émet alors de la lumière à sa longueur d'onde caractéristique. Un réseau de diffraction sépare les émissions, qui sont détectées par un dispositif à couple de charges (CCD) et la séquence est interprétée par ordinateur. En plus du séquençage en temps réel, la longueur de la séquence pouvant être analysée est supérieure à 500 pb.

Séquençage de Maxam et Gilbert:

Il s'agit d'une méthode chimique de séquençage développée par Maxam et Gilbert et la méthode est souvent utilisée pour le séquençage de petits fragments d'ADN tels que les oligonucléotides. Un marqueur radioactif est ajouté à l'extrémité 3 & 8242 ou 5 & 8242 d'une préparation d'ADN double brin. Les brins sont ensuite séparés par électrophorèse dans des conditions dénaturantes et analysés séparément.

L'ADN marqué à une extrémité est divisé en quatre aliquotes, chacune étant traitée avec des produits chimiques qui agissent sur des bases spécifiques par méthylation ou élimination des bases. Les conditions sont choisies de telle sorte que chaque molécule ne soit modifiée qu'à une seule position sur sa longueur et que chaque base du brin d'ADN ait des chances égales d'être modifiée.

Après les réactions de modification, des échantillons séparés sont clivés par la pipéridine, qui rompt les liaisons phosphodiester exclusivement du côté 5 & 8242 des nucléotides dont la base a été modifiée. Le résultat est similaire à celui produit par la méthode de Sanger, puisque chaque échantillon contient maintenant des molécules radiomarquées de différentes longueurs, toutes avec une extrémité commune (l'extrémité marquée), et avec l'autre extrémité coupée au même type de base. L'analyse des produits de réaction par électrophorèse est comme déjà décrite pour la méthode de Sanger.


Marquage ADN

Les acides nucléiques sont facilement marqués avec des étiquettes qui facilitent la détection ou la purification. Diverses méthodes enzymatiques ou chimiques sont disponibles pour générer des acides nucléiques marqués avec des phosphates radioactifs, des fluorophores ou des nucléotides modifiés avec de la biotine ou de la digoxygénine par exemple.

Les acides nucléiques peuvent être marqués à leur extrémité 5´, leur extrémité 3´, ou dans toute la molécule selon l'application. Pour les réactions d'hybridation (Southern ou Northern blot), il est généralement avantageux de générer des sondes à activité spécifique élevée avec un marqueur distribué dans tout l'acide nucléique, par des techniques telles que la translation de coupure, l'amorçage aléatoire, par PCR ou in vitro transcription en utilisant des dNTP ou des NTP marqués. Pour les applications impliquant des interactions protéiques, telles que les tests de gel-shift ou les pull-downs, il est généralement avantageux de générer des sondes marquées aux extrémités pour empêcher l'interférence stérique de l'interaction. Ceci peut être réalisé avec des protocoles de marquage final ou avec une PCR utilisant des amorces portant la modification requise.

New England Biolabs propose un certain nombre de réactifs et de kits adaptés au marquage de l'ADN et de l'ARN simple brin ou double brin aux extrémités de la molécule ou de manière aléatoire dans tout l'acide nucléique.

Choisissez le type :

Ce produit est couvert par un ou plusieurs brevets, marques déposées et/ou droits d'auteur détenus ou contrôlés par New England Biolabs, Inc (NEB).

Bien que NEB développe et valide ses produits pour diverses applications, l'utilisation de ce produit peut exiger que l'acheteur obtienne des droits de propriété intellectuelle supplémentaires de tiers pour certaines applications.

Pour plus d'informations sur les droits commerciaux, veuillez contacter l'équipe de développement commercial mondial de NEB à l'adresse [email protected]

Ce produit est destiné à des fins de recherche uniquement. Ce produit n'est pas destiné à être utilisé à des fins thérapeutiques ou diagnostiques chez les humains ou les animaux.


Marquage transcriptionnel des sondes ARN

Pour certaines applications, l'ARN marqué au DIG est une sonde d'hybridation plus efficace que l'ADN marqué au DIG. Par exemple, les sondes d'ARN marquées DIG peuvent détecter des ARNm rares dans des quantités de nanogrammes d'ARN total. Ces sondes d'ARN marquées sont générées par in vitro transcription à partir d'une matrice d'ADN. Dans la méthode de transcription de l'ARN, l'ADN est cloné dans le site de clonage multiple d'un vecteur de transcription entre les promoteurs de différentes ARN polymérases (telles que l'ARN polymérase T7, SP6 ou T3). Le modèle est ensuite linéarisé par clivage du vecteur en un site unique (près de l'insert). Une ARN polymérase transcrit l'ADN d'insertion en une copie d'ARN antisens en présence d'un mélange de ribonucléotides (dont DIG-UTP). Au cours de la réaction, l'ADN peut être transcrit plusieurs fois (jusqu'à cent fois) pour générer une grande quantité de copies d'ARN pleine longueur marquées DIG (10-20 g d'ARN à partir de 1 g d'ADN dans une réaction standard). DIG est incorporé dans l'ARN environ tous les 25 à 30 nucléotides.

Principe de réaction

La matrice d'ADN à transcrire est clonée dans le site polylinker d'un vecteur de transcription approprié, qui contient des promoteurs pour les ARN polymérases SP6 et/ou T3 et T7. Après linéarisation en un site approprié, l'ARN est transcrit en présence de DIG-11-UTP. Dans des conditions standard, environ 10 g d'ARN marqué au DIG de pleine longueur sont transcrits à partir de 1 g de matrice.

Les conseils suivants sont essentiels pour un marquage réussi des sondes d'ARN :

RNases

Les RNases sont omniprésentes et ne nécessitent aucun cofacteur pour leur activité. Si vous voulez réussir, prenez toutes les précautions possibles pour éviter la contamination par la RNase. Par exemple:

  • Il est recommandé d'utiliser de la vaisselle jetable en plastique, de la verrerie cuite au four ou de la vaisselle en plastique qui a été décontaminée avec de la RNase ZAP ou des réactifs similaires.
  • Préparez toutes les solutions avec de l'eau qui a été traitée avec du diéthyl-pyrocarbonate (DEPC) ou du diméthyldicarbonate (DMDC) et autoclavez les solutions.
  • Portez des gants tout au long de la procédure.
  • L'efficacité du marquage dépend grandement de la pureté de la matrice d'ADN. Le modèle doit être hautement purifié.
  • La matrice finale doit être linéarisée, extraite au phénol/chloroforme et précipitée à l'éthanol.

Séquence de modèles

  • Certaines régions d'amorces et/ou de polylinker dans les matrices d'ADN sont homologues à des portions des séquences d'ARN 28s et 18s ribosomiques. Par conséquent, les sondes marquées peuvent générer des signaux spécifiques mais indésirables dans les échantillons qui contiennent ces ARN proéminents. Pour minimiser cet effet, supprimez autant de séquences de polylinker de votre modèle que possible.
  • Si vous utilisez la PCR pour créer la matrice d'ADN, le produit de la réaction Expand High Fidelity contient des fragments avec un seul surplomb de 3' A. Ce surplomb peut produire des produits enveloppants dans la réaction de marquage transcriptionnel.

Longueur du modèle

  • La longueur optimale du modèle est d'environ 1 ko
  • La longueur minimale doit être d'au moins 200 pb

Rangement de la sonde

  • Pour une stabilité à long terme, les sondes d'ARN doivent être aliquotées et stockées à -20 °C ou -70 °C
  • Les sondes d'ARN marquées DIG sont stables pendant au moins 1 an à -20 °C ou -70 °C dans l'éthanol

Sensibilité de la sonde

  • Pour déterminer rapidement la sensibilité d'une sonde d'ARN antisens marquée DIG, préparez l'ARN sens correspondant (non marqué) en in vitro transcription. Ensuite, utilisez le transcrit sens purifié à des concentrations variables comme cible sur un Northern blot. À partir du résultat du transfert, vous pouvez facilement déterminer la plus faible quantité de cible (transcription sens) pouvant être détectée par une sonde marquée (transcription antisens).

Comment se produit l'hybridation des sondes ?

Traditionnellement, la méthode est connue sous le nom de Southern blot (pour l'hybridation d'ADN) ou Northern blot (pour l'hybridation d'ARN).

Dans la toute première étape, la séquence d'ADN qui nous intéresse est digérée par l'endonucléase de restriction et permet de s'immobiliser sur le papier de nitrocellulose.

Une sonde complémentaire est sélectionnée, marquée et dénaturée en premier.

Puis à l'étape suivante, le mélange sonde permet de se lier sur le papier nitrocellulosique, s'il trouve la séquence complémentaire exacte, il se liera.

Les sondes non liées sont éliminées par lavage du papier de nitrocellulose avec le tampon de lavage.

Les résultats finaux sont recueillis par la méthode d'autoradiographie.

Dans la version moderne de cette technique, appelée microarray, les sondes sont hybridées à la place de l'échantillon d'ADN.

L'échantillon est autorisé à s'hybrider sur la surface contenant des millions de sondes, ainsi le microarray permet de cribler de nombreuses mutations ou altérations à la fois.


ADN et ARN (avec diagramme)

Watson et Crick (1953) ont proposé un modèle pour la structure de la molécule d'ADN qui est maintenant généralement accepté par tous. Selon ce modèle appelé modèle Watson Crick, la molécule d'ADN est une structure à double hélice composée de deux longues chaînes de polynucléotides enroulées l'une autour de l'autre autour d'un axe imaginaire et opposées l'une à l'autre. (Fig. 9.14).

Chaque chaîne polynucléotidique est constituée de milliers d'unités nucléotidiques.

Le squelette des deux hélices de la chaîne polynucléotidique est constitué de phosphates de désoxyribose tandis que les bases sont présentes sur les faces internes.

Les bases d'une chaîne polynucléotidique sont complémentaires des bases de l'autre chaîne polynucléotidique et sont reliées entre elles par des liaisons hydrogène (Fig. 9.16).

L'appariement des bases est très spécifique (Fig 9.15), Les bases complémentaires sont :-

Le rapport des bases puriques et pyrimidiques est de 1: 1.

La distance entre deux paires de bases suivantes dans la chaîne polynucléotidique est de 3,4 Â.

Chaque tour des deux chaînes polynucléotidiques est terminé après 10 paires de bases, c'est-à-dire une distance de 34 Â.

La distance entre l'axe et la région du phosphate de sucre est d'environ 10 . L'enroulement hélicoïdal est droitier.

(1. Les molécules d'ADN sont gigantesques. Leurs poids moléculaires sont de l'ordre de plusieurs millions. 2. Dans certains bactériophages, c'est-à-dire les virus qui attaquent les bactéries, l'ADN est simple brin.)

Il existe différentes formes d'ADN dans les organismes vivants, à savoir A, B, C et rarement D et E. Dans toutes ces formes, l'enroulement hélicoïdal de la molécule d'ADN est droitier. Ces formes diffèrent par le nombre de paires de bases (pb) par tour, le diamètre de l'hélice et d'autres détails mineurs similaires. La forme d'ADN la plus courante et la plus courante dans les organismes vivants est la forme B, appelée ADN-B. L'exposé précédent de la structure de l'ADN se rapporte en fait à l'ADN-B.

Récemment, une autre forme d'ADN a été artificiellement synthétisée dans laquelle l'enroulement hélicoïdal de l'ADN est gauche et le squelette phosphate des polynucléotides suit un parcours en zigzag. Cette forme d'ADN a donc été désignée sous le nom d'ADN-Z. Certaines des autres caractéristiques importantes de Z-DNA one : 1. Chaque tour des deux chaînes polynucléotidiques est terminé après 12 paires de bases, c'est-à-dire une distance d'environ 45 Å. 2. La distance entre deux paires de bases suivantes est de 3,7 . 3.

La distance entre l'axe et le sucre-phosphate est de 9 Å. 4. Les unités de sucre désoxyribose alternatives dans la chaîne polynucléotidique ont une orientation inverse (une telle unité ayant de l'oxygène éthéré orienté vers le haut et l'autre unité suivante orientée vers le bas).

Acide nucléique ribose (ARN) :

L'ARN est une structure simple brin constituée d'une seule chaîne polynucléotidique. Si parfois les bases complémentaires sont très proches les unes des autres, des liaisons hydrogène s'établissent entre elles pour donner à la chaîne polynucléotidique un aspect hélicoïdal comme l'ADN.

L'ARN est constitué des bases suivantes :

Le rapport des bases puriques et pyrimidiques n'est pas de 1:1.

Le sucre pentose est le -D-ribose.

La taille de la molécule d'ARN est très petite par rapport à la molécule d'ADN. Poids moléculaire d'ARN peut aller de plusieurs milliers à quelques lakhs.

Il existe 3 formes différentes d'ARN dans les cellules végétales :

Poids moléculaire d'ARNm est plus élevé parmi les différents types d'ARN, variant généralement de 5 à 10 lakhs. Ceux-ci constituent 5 à 10 % de l'ARN total de la cellule.

L'ARNm est synthétisé dans le nucléole et, après avoir extrait l'information génétique de l'ADN, pénètre dans le cytoplasme et aide à la formation d'une protéine spécifique. Les ARNm sont de courte durée.

La séquence de 3 bases de nucléotides dans la molécule d'ARNm constitue un codon. En fait, l'information génétique obtenue à partir de l'ADN est codée dans des codons qui lui sont spécifiques (pour les dé­tails voir code génétique).

(ii) ARN ribosomique (ARNr):

L'ARNr se trouve dans le ribosome qui sert de matrice pour la synthèse des protéines. Il est du type le plus stable et constitue environ 80% de l'ARN total dans la cellule.

(iii) ARN de transfert ou soluble (ARNt ou s-ARN):

Les structures de nombreuses molécules d'ARN-t sont connues de manière assez détaillée. Celles-ci sont comparativement très petites avec un poids moléculaire d'environ 25 000. La structure de base de toutes les molécules d'ARN-t se trouve sur le motif des feuilles de trèfle. Le modèle de feuille de trèfle de l'ARN-t est présenté sur la figure 9.17.

Les ARNt se trouvent dans le cytoplasme et ne sont constitués que d'environ 80 bases. Ceux-ci constituent 10 à 15 % de l'ARN total dans la cellule.

Les ARNt contiennent de nombreuses bases et nucléotides inhabituels. Ce sont, par exemple, la pseudouridine (Ψ), la dihydrouridine (DHU), l'inosine (I), etc. La méthylation des bases est également courante.

Toutes les molécules d'ARNt contiennent de la guanine (G) à l'extrémité 5 & 8242. L'extrémité 3 & 8242 se termine toujours dans la séquence de bases Cytosine-Cytosine-Adénine (CCA). Au cours de la synthèse des protéines, cette extrémité récupère en fait l'acide aminé et le transfère à la chaîne polypeptidique en croissance. Par conséquent, ces ARN sont appelés ARN-t ou ARN de transfert.

Ces ARN-t sont également appelés ARN-s ou ARN solubles car ils sont solubles dans le NaCl IM.

Les molécules d'ARN-t sont repliées dans un motif de feuille de trèfle avec au moins trois ré­gions doubles hélicoïdaux (comme l'ADN) se terminant par des boucles.

Les trois boucles importantes de l'ARN-t sont :

(ii) Boucle de liaison à l'amino acyl synthétase

(iii) Boucle de liaison ribosomique.

La boucle anticodon est constituée de 7 bases. A l'extrémité libre, 3 bases non appariées constituent l'anticodon qui est complémentaire du codon dans l'ARNm. La boucle de liaison de l'aminoacyl synthétase se compose de 8 à 12 bases. En raison de la présence de dihydrouridines dans cette boucle, elle est également connue sous le nom de boucle DHU.

La boucle de liaison ribosomique est constituée de 7 bases. In contient la séquence de GTΨC et est donc également appelé boucle GTΨC.

Il existe différentes molécules d'ARN-t avec des anticodons spécifiques pour capter des acides aminés spécifiques. Cependant, de nombreux ARNt peuvent être spécifiques à un acide aminé particulier ou une seule espèce d'ARNt peut reconnaître plusieurs acides aminés.

La molécule d'ARN-t dont la structure a d'abord été donnée en détail par Holley est l'alanyle-t-ARN de levure (Fig. 9.18).


Acides nucléiques 7,1 HL

Les bases de la structure de l'ADN et de la réplication de l'ADN ont été abordées dans le sujet SL. des régions d'ADN qui ne codent pas pour les protéines mais qui régulent l'expression des gènes, forment des introns, des télomères ou des gènes pour l'ARNt. Pour comprendre le fonctionnement des machines de séquençage modernes, une compréhension claire de la PCR et de l'électrophorèse sur gel est également nécessaire.

Concepts clés

Apprenez et testez votre vocabulaire biologique pour les acides nucléiques 7.1 à l'aide de ces cartes mémoire.

Essentials - révision rapide de l'ensemble du sujet

Ces diapositives résument la compréhension et les compétences essentielles sur ce sujet.
Ils contiennent de courtes explications en texte et en images - une bonne révision pour tous les étudiants.

Lisez les diapositives et recherchez les mots ou les détails que vous trouvez difficiles à comprendre.

Question de style examen

Comment se préparer à répondre à une question difficile de l'IB sur la réplication de l'ADN.
À partir de vos notes de révision, créez entre 8 et 10 questions rapides.
Testez-vous. Vous souvenez-vous des réponses ?

1. Que fait l'hélicase ?
2. Quelles protéines séparent les brins d'ADN ?
3. Quel est le rôle de l'enzyme primase ?
4. En quoi l'ADN polymérase III est-elle différente de la primase ?
5. Dans quelle direction se trouve l'ADN polymérase III le long de la matrice ?
6. Quel est le brin principal ?
7. Quel est le brin retardé ?
8. Pourquoi des fragments d'okazaki sont-ils produits sur le brin retardé ?
9. Quel est le rôle de l'enzyme ADN polymérase I ?
10. Quel est le rôle de l'enzyme ADN ligase ?

Sépare les deux brins d'ADN en brisant les liaisons hydrogène.

2. Quelles protéines séparent les brins d'ADN ?

Protéines de liaison simple brin.

3. Quel est le rôle de l'enzyme primase ?

La primase attache une amorce d'ARN au brin d'ADN.

4. En quoi l'ADN polymérase III est-elle différente de la primase ?

L'ADN polymérase III ajoute des nucléotides d'ADN, Primase ajoute des nucléotides d'ARN au brin.

5. Dans quelle direction se trouve l'ADN polymérase III le long de la matrice ?

6. Quel est le brin principal ?

Le brin auquel l'ADN polymérase III peut ajouter des nucléotides en continu.

7. Quel est le brin retardé ?

Le brin sur lequel l'ADN polymérase III ne peut agir que sur de courtes sections.

8. Pourquoi des fragments d'okazaki sont-ils produits sur le brin retardé ?

L'ADN polymérase III ne peut pas produire un nouveau brin en continu.

9. Quel est le rôle de l'enzyme ADN polymérase I ?

L'ADN polymérase I remplace les nucléotides d'ARN de l'amorce par des nucléotides d'ADN.

10. Quel est le rôle de l'enzyme ADN ligase ?

L'ADN ligase relie les fragments d'okazaki entre eux.

Liste récapitulative pour le sujet 7.3 Traduction

  • Une partie du superenroulement de l'ADN est constituée de structures appelées nucléosomes.
  • La structure de l'ADN donne un indice sur le mécanisme de réplication de l'ADN.
  • Les régions non codantes de l'ADN ont d'autres fonctions importantes, limitées aux régulateurs de l'expression des gènes, aux introns, aux télomères et aux gènes des ARNt.

Réplication de l'ADN (chez les procaryotes uniquement)

  • Les enzymes ADN polymérase ne peuvent ajouter des nucléotides qu'à l'extrémité 3 & rsquo d'une amorce.
  • La réplication continue de l'ADN se produit sur le brin principal et discontinue sur le brin retardé.
  • Un groupe complexe d'enzymes effectue la réplication de l'ADN, notamment l'hélicase, l'ADN gyrase, les protéines de liaison simple brin, l'ADN primase et les ADN polymérases I et III.
  • La réplication de l'ADN produit une deuxième chromatide dans chaque chromosome en interphase avant la méiose.
  • Le croisement échange des morceaux d'ADN entre des chromatides homologues non sœurs et forme de nouvelles combinaisons d'allèles sur les chromosomes formés lors de la méiose.
  • Voyez que les travaux de diffraction des rayons X de Rosalind Franklin et de Maurice Wilkins ont mis en évidence une hélice et deux brins dans la structure de l'ADN.
  • Prise de conscience que la méthode Sanger de séquençage des bases utilise des nucléotides contenant de l'acide didésoxyribonucléique (ADN avec désoxyribose manquant 2 molécules d'oxygène) pour arrêter la réplication de l'ADN à une base spécifique qui permet le séquençage à l'aide de marqueurs fluorescents et d'ordinateurs. (Terminaison de la chaîne Sanger. Vidéo ici).
  • Prise de conscience que dans le profilage de l'ADN, des répétitions en tandem sont utilisées car elles varient considérablement d'une personne à l'autre.
  • Capacité d'analyser les résultats de l'expérience Hershey et Chase fournissant la preuve que l'ADN est le matériel génétique. (C'est un beau graphique).
  • Analyse de visualisations moléculaires de l'association protéine-ADN dans un nucléosome.

Les cartes mentales

Ces résumés de diagrammes couvrent les principaux détails du sujet 3.5 Modification génétique.
Étudiez-les et dessinez votre propre liste ou carte conceptuelle, de mémoire si vous le pouvez.

Testez-vous - questions à choix multiples

Ce quiz contient des questions à choix multiples couvrant les compréhensions et les compétences de ce sujet.

7.1 Structure et réplication de l'ADN 1 / 1

On estime qu'un grand pourcentage de l'ADN humain est "non codant".

Laquelle des réponses suivantes répertorie les fonctions importantes de ces régions non codantes ?

Allèles et gènes récessifs pour les molécules d'ARNt

Régulateurs de l'expression des gènes et gènes des enzymes de réplication de l'ADN

Exons et gènes pour les molécules d'ARNt

Les régions non codantes de l'ADN ont d'autres fonctions importantes, limitées aux régulateurs de l'expression des gènes, aux introns, aux télomères et aux gènes des ARNt.

Lequel des éléments suivants est un rôle des nucléosomes chez les eucaryotes ?

Une partie du superenroulement de l'ADN.

Initiation à la traduction.

Le superenroulement de l'ADN implique de nombreuses étapes, mais la formation de nucléosomes en est une partie importante. L'ADN est enroulé deux fois autour d'un groupe de protéines histones.
Aussi : La transcription est en partie régulée par les nucléosomes chez les eucaryotes.

À quelle partie d'une amorce d'ARN les enzymes de l'ADN polymérase III peuvent-elles ajouter des nucléotides ?

Les enzymes ADN polymérase ne peuvent ajouter des nucléotides qu'à l'extrémité 3 & rsquo d'une amorce.

Ce diagramme montre un diagramme simplifié de la réplication de l'ADN.

Quel énoncé décrit le mieux ce qui est montré par le diagramme ?

La réplication se fait dans une direction 5 & 39 à 3 & 39 sur le brin avant mais l'inverse sur le brin arrière.

La réplication est plus rapide sur le brin retardé que sur le brin leader.

La réplication est continue sur le brin avant et discontinue sur le brin arrière.

La réplication se produit de la même manière sur les brins en avance et en retard.

La réplication continue de l'ADN se produit sur le brin principal et discontinue sur le brin retardé.

Lequel des énoncés suivants donne un ordre logique dans l'action de seulement trois des enzymes du groupe complexe d'enzymes qui effectuent la réplication de l'ADN ?

ADN polymérase III, ADN gyrase, ADN polymérase I

Hélicase, ADN polymérase I, ADN polymérase III

Hélicase, ADN primase, ADN polymérase III

ADN polymérase I, ADN gyrase, ADN primase

Un groupe complexe d'enzymes effectue la réplication de l'ADN, notamment l'hélicase, l'ADN gyrase, les protéines de liaison simple brin, l'ADN primase et les ADN polymérases I et III. (également ADN ligase)

L'ADN gyrase et l'hélicase se déroulent et décompressent le brin d'ADN, de sorte que l'ADN primase puisse attacher une amorce.
Ensuite, l'ADN polymérase III ajoute des nucléotides d'ADN à l'extrémité 3 & 39 de l'amorce. Les nucléotides d'ARN de l'amorce sont remplacés par des nucléotides d'ADN par l'ADN polymérase I.

Quelle est la meilleure description de 'crossing-over'

L'échange de morceaux d'ADN entre chromatides sœurs de chromosomes homologues

L'échange de morceaux d'ADN entre chromatides sœurs d'autosomes

L'échange de morceaux d'ADN entre chromatides non sœurs de chromosomes homologues.

L'échange de morceaux d'ADN entre les chromatides non sœurs des chromosomes sexuels.

La réplication de l'ADN produit une deuxième chromatide dans chaque chromosome en interphase avant la méiose.

Le croisement échange des morceaux d'ADN entre des chromatides homologues non sœurs et forme de nouvelles combinaisons d'allèles sur les chromosomes formés lors de la méiose.

Le diagramme montre deux particules virales bactériophages utilisées dans une expérience célèbre par Hershey et Chase.

Pourquoi ont-ils utilisé de l'ADN marqué dans l'un et des protéines marquées dans l'autre ?

Ils cherchaient des preuves de croisement dans l'ADN.

Ils voulaient identifier les enzymes et les nucléotides dans la réplication de l'ADN.

Ils voulaient savoir si la protéine ou l'ADN était héritée par la progéniture.

Ils voulaient voir quelle molécule pénétrait dans les cellules de la bactérie hôte.

L'expérience Hershey et Chase a fourni la preuve que l'ADN est le matériel génétique.

Dans leurs expériences, ils ont montré que le marqueur radioactif était transmis à l'ADN de la prochaine génération de bactériophages.


RÉPONSES CORRECTES

La centrifugation en gradient de chlorure de césium fractionne les macromolécules en fonction de leurs densités de flottabilité : en fin de centrifugation, les macromolécules de densités plus élevées et plus faibles sont respectivement plus proches ou plus éloignées du fond du tube (QCM 2 : A). Density labeling of nitrogen containing macromolecules (MCQ 1: E) with heavy ( 15 N) and light ( 14 N) nitrogen isotopes as described in the protocol of this test generated DNA molecules of three distinct densities: heavy (Peak I), intermediate (Peak II), and light (Peak III). Analysis of the appearance and amount (MCQ 3: C) of these DNA species provided information to describe the mechanism of replication in E. coli cellules.

DNA replication, theoretically, could proceed according to three mechanisms [ 3 ]. According to the conservative model (Fig. 3 une), at the end of the replication, the template would remain intact and the daughter DNA would consist of two newly synthesized strands.

Possible models of DNA replication: conservative (une), semiconservative (b), and dispersive (c).

This mechanism would generate heavy and light DNA molecules only. In the semiconservative mechanism (Fig. 3 b), the two strands of the parental DNA molecule would unwind and serve as templates for the synthesis of new, complementary strands. The dispersive model (Fig. 3 c) predicts that both strands of the daughter DNA molecule contain old and newly synthesized regions. In both latter cases, the appearance of DNA molecules of intermediate density is expected after the first replication on the 14 NH4Cl containing medium (MCQ 4: C). Upon heat-denaturation and alkaline cesium chloride gradient centrifugation of Peak II DNA (that triggers and maintains the separation of the DNA strands, respectively MCQ 5: A, MCQ 6: B), two absorption peaks appeared corresponding to heavy and light DNA molecules (MCQ 9: A, MCQ 10: A). This observation strongly supports the semiconservative mechanism (MCQ 11: E). (In the case of dispersive DNA replication, denaturation of Peak II DNA would not change the behavior of the DNA molecules during cesium chloride gradient centrifugation.) The semiconservative model would predict that the ratio of light versus intermediate density DNA would increase in successive DNA replication cycles (Fig. 4 MCQ 12: D). DNA replication was completed in 48 min in this experiment (note the complete disappearance of the original, “heavy” template DNA in Fig. 1 b MCQ 7: A). By 92 min (Fig. 1 c), the second replication cycle was finished (MCQ 8: B).

Density distribution of DNA molecules generated during the first 3 replication cycles of the Meselson-Stahl experiment.


Voir la vidéo: From DNA to protein - 3D (Août 2022).