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Transfecter des cellules de mammifères avec de l'ADN simple brin ?

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Les agrobactéries peuvent livrer des parties de leur ADN aux cellules végétales sous forme d'ADN-T, transférer l'ADN. Cet ADN est délivré sous forme d'un simple brin et peut être intégré dans le génome de la plante ou peut être converti en une molécule double brin en amorçant l'ADN-T pour en faire un substrat pour une ADN polymérase. Cet article décrit le processus, mais la nature rend difficile l'accès à l'article, désolé.

Ce qui m'intéresse, c'est la livraison d'ADN aux cellules de mammifères. J'ai essayé de trouver des articles qui utilisaient de l'ADN simple brin dans des cellules de mammifères, mais je n'ai pas trouvé grand-chose. Peut-être que je n'ai pas passé assez de temps à chercher. J'ai vu des suggestions selon lesquelles l'ADN simple brin pourrait déclencher l'apoptose, ou que l'ADN simple brin pourrait être utilisé pour manipuler les mécanismes de réparation de l'ADN afin de provoquer l'intégration dans le génome.

Cependant, existe-t-il un moyen de délivrer un ADN simple brin et de le convertir en plasmide double brin in situ ? Aurait probablement besoin d'une amorce d'ARN ou d'ADN, mais je ne vois pas pourquoi vous ne pourriez pas pré-lier l'amorce et livrer tout le complexe.


ADN simple brin utilisé comme nouveau véhicule efficace pour la transformation de protoplastes végétaux

En ce qui concerne la question de savoir quelle forme d'ADN (simple ou double brin) est transférée par Agrobacterium tumefaciens aux cellules végétales, nous avons étudié le comportement de l'ADN simple brin, par rapport à l'ADN double brin, lorsqu'il est introduit dans des protoplastes végétaux par électroporation. Pour cela, nous avons cloné une construction avec un gène NPTII végétal ainsi qu'un gène CAT dans les vecteurs M13 tg130 et tg131. Nous avons découvert que les deux molécules simple brin complémentaires donnaient lieu à une activité CAT substantielle dans les protoplastes végétaux, suggérant que l'ADN simple brin est converti en ADN double brin par la machinerie de réplication des cellules végétales. De manière inattendue, nous avons découvert que l'ADN simple brin conduit à une fréquence de transformation stable 3 à 10 fois plus élevée (sélection pour la résistance à la kanamycine) que l'ADN double brin. Ces résultats indiquent que l'utilisation d'ADN simple brin pourrait être envisagée dans des expériences dans lesquelles des fréquences de transformation optimales sont nécessaires, par exemple. avec des protoplastes forment des espèces végétales récalcitrantes.

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Transfection et recombinaison homologue impliquant des substrats d'ADN simple brin dans des cellules de mammifères et des extraits nucléaires

Nous avons examiné la capacité de l'ADN simple brin à participer à des réactions de recombinaison homologue dans des cellules de mammifères et des extraits nucléaires qui en dérivent. Nous avons inséré un fragment du gène neo dans le vecteur phagique à ADN simple brin M13 mp11. Le fragment néo était dérivé d'un dérivé de délétion du vecteur navette procaryote-eucaryote pSV2neo. L'ADN simple brin résultant a été mélangé avec un dérivé de délétion double brin de pSV2neo et testé pour la recombinaison dans des cellules humaines, des cellules de singe et des extraits nucléaires obtenus à partir de cellules humaines. Nous avons pu obtenir des molécules recombinantes contenant des gènes néo de type sauvage dans les trois systèmes. L'examen des produits de recombinaison a indiqué qu'ils résultaient de la correction de la délétion dans le substrat d'ADN double brin. Nous n'avons pas été en mesure de détecter une conversion étendue de l'ADN simple brin en son homologue double brin avant qu'il ne participe à la réaction de recombinaison. Nous avons également testé la capacité de l'ADN simple brin à produire des transfectants. Lorsqu'un dérivé d'ADN simple brin du gène de la thymidine kinase (TK) du virus de l'herpès simplex a été introduit dans des cellules L-M(TK-) de souris, nous avons pu obtenir des colonies TK+. A partir de ces résultats, nous concluons que l'ADN simple brin peut participer à la transfection ainsi qu'aux réactions de recombinaison homologue dans les cellules de mammifères.


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Transfection de miARN  

Transfection efficace de microARN

Le réactif de transfection d'ARN Xfect offre des niveaux élevés d'efficacité de transfection et de viabilité cellulaire pour six lignées cellulaires populaires différentes (figure 5).

Figure 5. Transfection efficace de microARN à l'aide du réactif de transfection d'ARN Xfect. Un mimique de microARN marqué au FAM a été transfecté dans six lignées cellulaires populaires à l'aide du réactif de transfection d'ARN Xfect conformément au protocole. 24 heures après la transfection, les cellules ont été récoltées et l'efficacité de la transfection a été déterminée par cytométrie en flux. La viabilité cellulaire a également été mesurée en utilisant la coloration au bleu Trypan. Les données représentent la moyenne de trois transfections indépendantes pour chaque lignée cellulaire.


PLANIFICATION STRATÉGIQUE

Choisir une stratégie de knock-out

Pour éliminer un gène d'intérêt, la nucléase Cas9 et un ARN guide spécifiant la cible doivent être délivrés à la cellule. Diverses plates-formes CRISPR sont adaptées pour générer des knock-out, y compris le système « tout-en-un » ou à un plasmide (dans lequel Cas9 et l'ARN guide sont codés sur le même vecteur), les systèmes à deux plasmides (dans lesquels Cas9 et l'ARN guide sont codés sur des vecteurs différents) et l'administration directe de ribonucléoprotéines. L'assemblage et la livraison de ribonucléoprotéines ont été décrits ailleurs (Farboud et al., 2018), et ce protocole se concentrera sur les stratégies de knock-out basées sur les plasmides.

L'efficacité de chaque système CRISPR est limitée par l'efficacité avec laquelle il peut être introduit et exprimé dans la cellule cible. Dans l'approche à deux vecteurs, un plasmide exprimant Cas9 est d'abord transduit de manière stable à l'aide de lentivirus dans la lignée cellulaire cible. Après la sélection pour l'expression de Cas9, cette lignée peut être facilement utilisée pour générer plusieurs clones knock-out en exprimant différents ARN guides. Cependant, l'expression constitutive de Cas9 peut conduire à des niveaux plus élevés de mutagenèse hors cible, et certaines lignées cellulaires ont tendance à réduire au silence les protéines exprimées de manière virale (Ellis, 2005). Dans l'approche à vecteur unique, le plasmide Cas9/gRNA unique peut être introduit dans les cellules par transfection ou transduction. Cependant, la taille du provirus généré à partir du vecteur tout-en-un est proche de la limite d'encapsidation lentivirale, ce qui peut diminuer les titres viraux ultérieurs (Kumar, Keller, Makalou et Sutton, 2001). En général, si un chercheur cherche à analyser différents knockouts dans la même lignée cellulaire, nous recommandons d'utiliser l'approche à deux vecteurs et de générer une lignée cellulaire exprimant Cas9 stable. Si un chercheur cherche à analyser un seul knock-out et à minimiser les effets hors cible, alors la transfection transitoire du vecteur tout-en-un peut être supérieure. Un certain nombre de laboratoires ont développé des plasmides CRISPR avec une résistance aux médicaments et des marqueurs fluorescents pratiques. Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de plasmides qui ont été générés et validés par notre propre laboratoire et par le laboratoire Vakoc du Cold Spring Harbor Laboratory, bien que de nombreux autres vecteurs CRISPR disponibles auprès d'Addgene puissent être utilisés à leur place.

Le nombre d'ARNg introduits dans les lignées cellulaires variera en fonction des objectifs expérimentaux du projet et des caractéristiques uniques du gène d'intérêt. L'utilisation d'un ARNg est souvent suffisante pour éliminer le gène cible dans une partie des cellules d'une population (Popp & Maquat, 2016). Cependant, comme décrit dans le Commentaire ci-dessous, l'épissage alternatif, l'initiation de la traduction en aval et la production de fragments de protéines fonctionnelles peuvent parfois permettre aux cellules de contourner des lésions uniques induites par Cas9 (Lalonde et al., 2017 Sharpe & Cooper, 2017). Pour maximiser la probabilité d'invalider un gène cible, une stratégie à deux guides peut être utilisée. Dans cette approche, deux ARNg, ciblant deux exons distincts, sont introduits dans les cellules. Cette double coupure peut être réparée soit par la génération de deux mutations indépendantes, soit par l'élimination de l'ADN entre les deux sites ciblés. Il est important de noter que l'introduction de plusieurs ARN guides dans une cellule peut entraîner une augmentation de la mutagenèse hors cible. Ainsi, il reste crucial de valider les phénotypes knock-out en utilisant différentes combinaisons d'ARN guides et en analysant plusieurs clones indépendants par western blot, PCR et séquençage.

De plus, lors de la génération de lignées cellulaires KO, il est souvent utile d'avoir des lignées cellulaires de contrôle pour les comparaisons expérimentales en aval. À cette fin, nous générons souvent des lignées clonales dérivées d'une seule cellule à partir de cellules abritant des ARNg ciblant les loci Safe Harbor. Rosa26 ou AAVS1.

Guider le clonage d'ARN

Pour commencer, les ARNg ciblant le gène d'intérêt doivent d'abord être clonés dans le vecteur d'expression d'ARNg de choix.

1 : ISOLEMENT DE L'ADN PLASMIDE

Afin de cloner des séquences d'ARNg dans les étapes ultérieures du protocole (protocole de base 1), il est nécessaire de d'abord purifier des quantités suffisantes de l'épine dorsale du plasmide d'ARNg (tableau 1). Ces squelettes plasmidiques peuvent être obtenus auprès d'Addgene.

Plasmide(s) Addgene non. But
Systèmes knock-out à un plasmide
Lenti-Cas9-ARNg-GFP 124770 Coexprimer Cas9, un ARNg et la GFP
Lenti-Cas9-ARNg-TagBFP2 124774 Coexprimer Cas9, un ARNg et TagBFP2
Systèmes knock-out à deux plasmides
LentiV_Cas9_puro 108100 Exprime Cas9 avec résistance à la puromycine
LRG2.1 108098 Exprime un ARNg avec GFP
LRCerry2.1 108099 Exprime un ARNg avec mCherry
Lenti_sgRNA_EFS_BFP 120577 Exprime un ARNg avec eBFP
LRG2.1-mOrange 124772 Exprime un ARNg avec mOrange
LRG2.1-CyOFP1 124771 Exprime un ARNg avec CyOFP1
LRG2.1-TagBFP2 124773 Exprime un ARNg avec TagBFP2

Matériaux

  • Plasmide(s) d'intérêt (Addgene)
  • Approprié Escherichia coli souche
  • LB + 100 µg/ml milieu ampicilline
  • 50% (v/v) de glycérol
  • Kit GeneJET Plasmid Maxiprep (Thermo Fisher Scientific réf. K0491)
  • Spectrophotomètre NanoDrop ou équivalent
  • Tubes de congélation de 1,5 ml
  • Microtubes à centrifuger de 1,5 ml

1. Obtenez le ou les plasmides souhaités auprès d'Addgene.

2. Après avoir reçu la culture stab de E. coli, ensemencer les bactéries dans 2 ml de milieu LB + 100 µg/ml ampicilline pendant une nuit à 37°C.

3. Le lendemain, préparer les stocks de glycérol en remettant en suspension 500 µl de la culture bactérienne dans 500 µl de glycérol à 50 % et conserver dans des tubes de congélation de 1,5 ml à -80°C. De plus, transférez 1 ml de la culture d'une nuit dans 250 ml de milieu LB + 100 µg/ml d'ampicilline et laissez pousser pendant 12 à 18 heures supplémentaires à 37 ° C.

4. Isoler les plasmides du E. coli stock en utilisant le kit GeneJET Plasmid Maxiprep conformément aux instructions du fabricant. Quantifier la concentration et la pureté de l'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop et stocker des aliquotes du stock portant le plasmide dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml à -20°C pour une utilisation ultérieure.

2 : PRÉPARATION DU STBL3 COMPÉTENT E. COLI POUR LE CLONAGE D'ARNg

Les séquences répétitives dans les plasmides lentiviraux CRISPR peuvent être instables lorsque les plasmides sont propagés dans E. coli. Nous recommandons donc de transformer les plasmides clonés construits dans le protocole de base 1 dans la souche Stbl3 déficiente en recombinaison de E. coli pour maximiser la stabilité du vecteur (Al-Allaf, Tolmacov, Zambetti, Tchetchelnitski, & Mehmet, 2013 ). Bien que l'achat de Stbl3 compétents préfabriqués soit très coûteux, nous générons nos propres lots de cellules Stbl3 compétentes à l'aide du kit de transformation Zymo Research Mix & Go.

Matériaux

  • One Shot™ Stbl3™ Chimiquement compétent E. coli (Référence Invitrogen C737303)
  • Mélangez et partez E. coli Kit de transformation et ensemble de tampons (N° cat. Zymo Research T3001)

1. Préparez de nouveaux lots de Stbl3 compétents E. coli en suivant les instructions du Kit Mix & Go.

2. Conserver les aliquotes de cellules à -80°C pour une utilisation ultérieure.

3 : OBTENTION DES OLIGONUCLEOTIDES D'ARN GUIDES

Les ARN guides sont clonés dans des vecteurs d'expression par digestion BsmBI. Une fois qu'une séquence d'ARN guide appropriée de 20 pb est identifiée, des séquences de restriction BsmBI doivent être ajoutées à chaque brin de la séquence d'ARNg, comme indiqué ici :

« CACCG » et « AAAC » sont ajoutés aux oligos pour assurer la compatibilité pour le clonage en utilisant une digestion BsmBI. Le C unique à l'extrémité 3' de l'oligo inverse est nécessaire pour hybrider la séquence au G supplémentaire ajouté à l'oligo direct. Les ARN guides ont généralement une longueur de 25 pb après l'ajout de ces modifications à la séquence d'ARN sg.

Les oligos synthétiques des guides conçus peuvent être achetés dans le commerce auprès d'Integrated DNA Technologies (IDT https://www.idtdna.com) ou de toute autre source commerciale. Généralement, 25 nmol d'oligos d'ADN d'IDT préparés avec un dessalage standard fournissent plus qu'assez de matériel pour le clonage d'ARNg (voir Planification stratégique pour les directives de conception d'ARNg). Bien que nous ayons fourni une liste de vecteurs exprimant l'ARNg que nous utilisons couramment dans le tableau 1, un certain nombre d'autres vecteurs d'ARNg peuvent être trouvés sur Addgene, et ces plasmides peuvent nécessiter l'utilisation d'enzymes de restriction alternatives.

Les oligos gRNA peuvent être clonés soit dans le vecteur gRNA (système à deux vecteurs) soit dans le vecteur « tout-en-un » (système à un vecteur) par digestion de restriction et ligature. Si l'approche à deux ARNg est choisie, chaque ARNg peut être cloné dans un vecteur avec différents marqueurs fluorescents pour permettre le tri en aval des cellules qui hébergent les deux ARNg. Le protocole de clonage de l'ARNg se compose de cinq étapes globales : (1) linéarisation du squelette plasmidique, (2) phosphorylation 5' et hybridation des oligonucléotides, (3) ligature des oligonucléotides hybridés dans le vecteur linéarisé, (4) transformation du produit de ligature dans les cellules Stbl3, et (5) vérification de la séquence de l'ARNg.

Matériaux

  • squelette plasmidique gRNA ou vecteur tout-en-un (Support Protocol 1)
  • Cellules Stbl3 compétentes (Support Protocol 2)
  • Endonucléase de restriction BsmBI et tampon NEB 3.1 (NEB cat. no. R0580)
  • Eau distillée et déminéralisée sans nucléase (ddH2O)
  • Phosphatase alcaline, stock intestinal de veau (CIP) (10 000 U/ml N° cat. NEB M0290)
  • NucleoSpin® Gel et nettoyage PCR (Macherey-Nagel réf. 740609.50)
  • 100 µM d'oligos d'ARNg (IDT ou autre fabricant de synthèse d'ADN, voir Strategic Planning and Support Protocol 3)
  • T4 polynucléotide kinase (NEB cat. no. M0201)
  • ADN ligase T4 et tampon approprié (NEB cat. no. M0202)
  • LB + 100 µg/ml plaques de culture ampicilline
  • LB + 100 µg/ml milieu ampicilline
  • 50% (v/v) de glycérol
  • Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen réf. 27106)
  • Amorce de séquençage U6 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′ (IDT ou autre fournisseur d'ADN)
  • Microtubes à centrifuger de 1,5 ml
  • Bloc thermique
  • Spectrophotomètre ADN NanoDrop ou équivalent
  • Tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml
  • Thermocycleur
  • Tubes de congélation de 1,5 ml
  • Réactifs et équipement supplémentaires pour l'électrophorèse sur gel d'agarose (article sur les protocoles actuels : Voytas, 2001)
  • 8 µg de squelette d'ARNg
  • 2 µl d'enzyme BsmBI
  • 5 µl de tampon NEB 3.1
  • ddH sans nucléase2O à 50 µl final.

2. Après 3 h de digestion, ajouter 1 µl de solution mère CIP à 10 000 U/ml à chaque réaction et incuber encore 1 h à 37°C.

3. Exécutez le mélange de digestion sur un gel d'agarose à 1%. Deux bandes doivent être observées (bandes autour de 11 et 2 kb pour le vecteur tout-en-un et bandes autour de 7,5 et 2 kb pour le squelette du vecteur du système à deux plasmides). À l'aide du kit de nettoyage NucleoSpin® Gel et PCR, découpez et extrayez la plus grande bande. Déterminer la concentration d'ADN du vecteur extrait à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop et conserver le vecteur linéarisé à -20°C.

  • 1 µl d'oligo avant (100 µM)
  • 1 µl d'oligo inverse (100 µM)
  • 1 µl de tampon ligase T4 10×
  • 6,5 µl de ddH sans nucléase2O
  • 0,5 ul d'enzyme T4 PNK.

5. Placer le tube de réaction dans un thermocycleur et exécuter le programme suivant :

30 minutes 37°C
5 minutes 95°C
5 minutes 90°C
5 s 80°C (rampe 0,1°C/s)
30 s 70°C (rampe 0,1°C/s)
30 s 60°C (rampe 0,1°C/s)
1 minute 50°C (rampe 0,1°C/s)
2 minutes 40°C (rampe 0,1°C/s)
2 minutes 30°C (rampe 0,1°C/s)
Tenir à 4°C.

6. Une fois le programme PCR terminé, diluer la réaction à 1:200 avec ddH sans nucléase2O et conserver à -20°C.

  • X µl (25 ng) vecteur digéré de l'étape 3
  • Y µl ddH2O à 10 µl de volume total
  • 1 ul d'oligo duplex phosphorylé et recuit de l'étape 6
  • 1 µl de tampon ligase T4 10×
  • 1 ul de ligase T4.

8. Transformer les vecteurs sgRNA en Stbl3 E. coli cellules, ajouter 5 ul de la réaction de ligature de l'étape 7 à 50 ul de cellules Stbl3. Laisser reposer le mélange sur la glace pendant 5 min.

9. Plaquez les dilutions appropriées du Stbl3 E. coli cellules sur des plaques LB + 100 µg/ml d'ampicilline et laisser pousser une nuit à 37°C.

10. Prélever trois à cinq colonies par ARNg et laisser croître dans 3 ml de LB + 100 µg/ml de milieu ampicilline pendant une nuit à 37°C.

11. Après une nuit de croissance, faire 1 ml de stocks de glycérol de chacune des colonies en mélangeant la culture LB 1:1 avec 50 % de glycérol et en stockant à -80°C.

12. Pour vérifier la séquence du plasmide sgRNA, générer un stock de glycérol (voir Protocole de support 1, étape 3), purifier les vecteurs des bactéries dans la culture liquide à l'aide du kit QIAprep Spin Miniprep et séquencer les plasmides avec l'amorce U6 .

L'amorce U6 initiera le séquençage dans la région du promoteur en amont de l'emplacement où le sgRNA doit être inséré.

Livraison CRISPR

  1. Transfection du plasmide CRISPR tout-en-un (Basic Protocol 5)
  2. Transfection d'un plasmide gRNA dans une lignée cellulaire exprimant Cas9 (génération de lignée cellulaire : protocoles de base 2 et 3 transfection : protocole de base 5)
  3. Transduction du plasmide CRISPR tout-en-un (Basic Protocol 2 et 4)
  4. Transduction d'un plasmide gRNA dans une lignée cellulaire exprimant Cas9 (génération de lignée cellulaire : protocoles de base 2 et 3 transduction : protocole de base 2 et 4).

En général, l'expression transitoire des composants CRISPR peut conduire à moins d'effets hors cible tout en diminuant l'efficacité sur cible. Les stratégies appropriées dépendront des objectifs expérimentaux particuliers des chercheurs et du ou des systèmes dans lesquels ils travaillent. Ci-dessous, nous décrivons divers protocoles de transfection et de transduction pour introduire les plasmides CRISPR dans les cellules d'intérêt.

2 : TRANSFECTION DE PHOSPHATE DE CALCIUM POUR PRODUIRE DES LENTIVIRUS

Tous les lentivirus utilisés dans ce protocole (particules virales contenant des plasmides qui expriment Cas9, un ARN guide ou le vecteur tout-en-un) sont générés dans des cellules HEK293T via une transfection au phosphate de calcium (Chang, Marran, Valentine et Hannon, 2013). Ce protocole de transfection implique l'utilisation de deux plasmides d'encapsidation virale (PsPAX2.0 et VSVG). Si l'approche à deux vecteurs est utilisée, des pools de lentiviraux distincts doivent être générés pour chaque vecteur.

Matériaux

  • Cellules HEK293T (ATCC CRL-3216)
  • ADN plasmidique CRISPR (plasmide « tout-en-un » ou plasmides gRNA/Cas9 du protocole de base 1)
  • Plasmide psPAX2.0 (plasmide Addgene n° 12260)
  • Plasmide VSVG (plasmide Addgene n° 12259)
  • 2M de CaCl2
  • Solution B (2x solution saline tamponnée à l'HEPES voir recette).
  • 100 mM de chloroquine (Cayman Chemical n° de cat. 14194)
  • Milieu DMEM additionné de 10 % de FBS, 1 % de Pen/Strep et de glutamine (Life Technologies n° de cat. 11995-073)
  • Plaques de culture tissulaire de 10 cm avec milieu de culture préféré pour les cellules DMEM/10 % FBS avec 1 % Pen/Strep et glutamine HEK293T
  • Tubes en polystyrène de 5 ml
  • Filtre 0,45 µM

1. Avant la transduction, divisez HEK293T sur une plaque de 10 cm pour obtenir des cellules confluentes à 70-80% au moment de la transfection.

  1. 20 µg d'ADN plasmidique CRISPR
  2. 25 µg de plasmide psPAX2.0
  3. 4 µg de plasmide VSVG
  4. ddH2O tel que requis pour un volume total de 500 µl
  5. 62,5 µl de CaCl 2 M2

3. Pipeter 500 µl de solution B dans un tube séparé.

4. Utilisez une pipette pour souffler des bulles dans la solution B tout en ajoutant goutte à goutte la solution A à la solution B.

Les bulles aideront à la formation uniforme des précipitants, ce qui est une étape cruciale pour déterminer le succès d'une transfection.

5. Incuber ce mélange 15 min à température ambiante.

6. Pendant l'incubation, ajoutez 2,5 µl de chloroquine 100 mM à la plaque de 10 cm de cellules HEK293T de l'étape 1.

7. Une fois l'incubation de 15 min terminée, ajouter le mélange de transfection goutte à goutte autour de la plaque de 10 cm, puis remettre la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37°C.

8. À 8-14 heures après la transfection, remplacez le milieu sur les cellules HEK293T avec du milieu DMEM FBS 10 % frais.

9. Commencer à collecter le virus 24 heures après la transfection. Pour récolter le virus, collecter tout l'ancien milieu sur les cellules HEK293T à l'aide d'une seringue. Séparez les débris cellulaires du surnageant viral à l'aide d'un filtre de 0,45 µM et stockez le surnageant à -80°C ou ajoutez-le immédiatement à une lignée cellulaire receveuse. En règle générale, le virus peut être collecté trois fois dans la fenêtre de 24 à 72 heures après la transfection. Pour effectuer plusieurs récoltes, ajoutez un volume égal de milieu aux cellules et répétez le protocole de collecte le lendemain. Le protocole peut également être augmenté (jusqu'à des plaques de 15 cm) ou réduit (jusqu'à des plaques de 6 ou 12 puits) selon les besoins.

Plusieurs des plasmides CRISPR décrits dans ce protocole contiennent un marqueur fluorescent et peuvent être facilement titrés. Pour déterminer le titre viral, ajoutez des volumes croissants de virus à une lignée cellulaire receveuse en utilisant le protocole de transduction répertorié ci-dessous. Trois jours après la transduction, quantifier la fraction de cellules fluorescentes pour chaque volume de virus afin de déterminer le nombre de particules infectieuses par microlitre de solution. Cependant, le titrage est souvent inutile, car le protocole de transfection ci-dessus est très efficace. Si un titrage est requis pour un plasmide viral non fluorescent, un kit qPCR peut être utilisé à la place (Clontech n° de cat. 631235).

3: GÉNÉRER UNE LIGNE CELLULAIRE EXPRESSANT CAS9

Lors de l'utilisation du système à deux vecteurs, une lignée cellulaire stable qui exprime Cas9 doit d'abord être générée. La lignée cellulaire peut ensuite être réutilisée dans plusieurs expériences de knock-out. Alternativement, un certain nombre de fournisseurs proposent des lignées cellulaires exprimant Cas9, dont certaines ont une expression Cas9 inductible (https://www.genecopoeia.com).

Matériaux

  • Surnageant lentiviral Cas9 de lentivirus généré à l'aide du protocole de transfection au phosphate de calcium (Protocole de base 2)
  • Lignée cellulaire de mammifère receveuse
  • Polybrène (Santa Cruz Biotechnology n° cat. sc-134220)
  • Agent sélectif approprié pour le plasmide utilisé
  • Réactifs et équipements supplémentaires pour la culture cellulaire et la trypsinisation (article des protocoles actuels : Phelan, 1996)

1. Trypsiniser les cellules cibles et les plaquer de manière à ce qu'elles soient 50 % confluentes.

2. Mélanger le surnageant de la culture lentivirale dans les cellules 1:1 : par exemple, ajouter 5 ml de surnageant viral à 5 ​​ml de culture cellulaire.

3. Ajouter du polybrène à 8 µg/ml final.

4. Changer de milieu 24 heures après la transduction.

5. À 48 heures après la transduction, sélectionnez pour l'expression Cas9.

Le plasmide lentiviral Cas9 le plus couramment utilisé dans notre laboratoire (plasmide Addgene n° 108100) abrite un marqueur de résistance à la puromycine, et nous sélectionnons les cellules exprimant Cas9 en utilisant 1 à 4 µg/ml de puromycine (Thermo Fisher Scientific n° cat. A11138- 03). Dans certaines lignées cellulaires, une expression suffisante de Cas9 peut être générée par un seul cycle de transduction suivi de 3 à 5 jours de sélection. Dans d'autres lignées cellulaires (en particulier celles qui font taire les transgènes viraux), l'expression optimale de Cas9 nécessite plusieurs cycles de transduction lentivirale suivis de 1 à 2 semaines de sélection de médicaments. L'expression de Cas9 peut être vérifiée dans la population à l'aide de qPCR, d'une analyse par transfert western ou par transduction avec un ARN guide ayant une activité biologique connue.

4: TRANSDUIRE LES ARN GUIDES OU LE VECTEUR TOUT-EN-UN DANS LES CELLULES BÉNÉFICIAIRES

L'ARN guide ou les vecteurs tout-en-un peuvent être introduits de façon permanente dans une lignée cellulaire receveuse par le protocole de transduction décrit ci-dessous.

Matériaux

  • Lignée cellulaire de mammifère receveur (utiliser la lignée cellulaire du protocole de base 3 pour le système à deux vecteurs)
  • Surnageant avec des lentivirus porteurs d'un vecteur gRNA cloné ou d'un vecteur tout-en-un (Protocole de base 2)
  • Polybrène (Santa Cruz Biotechnology n° cat. sc-134220)
  • plaques de culture 6 puits
  • Réactifs et équipements supplémentaires pour la culture cellulaire et la trypsinisation (article des protocoles actuels : Phelan, 1996)

1. Trypsiniser les cellules cibles et les plaquer dans des plaques à 6 puits de manière à ce qu'elles soient confluentes à ∼50 %.

Typiquement, le placage d'un puits de plus que le nombre de réactions de transduction est suffisant. Le puits supplémentaire peut être utilisé comme contrôle non transduit lors de la surveillance de l'efficacité de la transduction.

2. Mélanger le surnageant lentiviral dans le milieu de culture en 1:1 (ou en utilisant une quantité appropriée déterminée par titrage).

3. Ajouter du polybrène à 8 µg/ml final.

4. Changer de milieu 24 heures après la transduction.

5. Surveiller l'efficacité de la transduction en fonction du marqueur fluorescent présent sur l'ARNg ou le vecteur tout-en-un à l'aide d'un microscope à fluorescence.

5 : TRANSFECTION DES ARN GUIDES OU DU VECTEUR TOUT-EN-UN DANS LES CELLULES BÉNÉFICIAIRES

Des ARN guides ou des vecteurs tout-en-un peuvent être introduits temporairement dans une lignée cellulaire receveuse par diverses méthodes de transfection. Nous avons constaté que l'efficacité de la transfection peut varier considérablement pour différentes méthodes avec différentes lignées cellulaires réceptrices. En général, nous constatons que Lipofectamine 3000 est le plus susceptible de produire les taux de transfection les plus élevés avec le moins d'optimisation requise. Cependant, dans des circonstances particulières, d'autres réactifs (Lipofectamine 2000, TransIT-LT1, etc.) peuvent donner des résultats supérieurs. En général, nous recommandons de commencer par Lipofectamine 3000 puis de tester d'autres réactifs si nécessaire.

Pour introduire des plasmides CRISPR avec Lipofectamine 3000, nous utilisons le protocole suivant (légèrement modifié par rapport au protocole du fabricant).

Matériaux

  • Lignée cellulaire de mammifère bénéficiaire (utilisez la lignée cellulaire du protocole de base 3 pour le système à deux vecteurs)
  • Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific réf. L3000001)
  • Réactif P3000 (fourni avec Lipofectamine 3000)
  • Milieu de sérum réduit Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific n° cat. 31985088)
  • Vecteur gRNA cloné ou vecteur tout-en-un
  • Support sans stylo/strep
  • Tubes en polystyrène de 5 ml
  • Matériaux de culture cellulaire
  • Plaques de culture tissulaire 6 puits
  • Microscope à fluorescence

1. Plaquez la lignée cellulaire cible de manière à ce qu'elle soit confluente à 60-80% dans une plaque à 6 puits le lendemain.

2. Réchauffer les réactifs de transfection à température ambiante.

3. Ajouter 7,5 µl de réactif Lipofectamine 3000 à 125 µl de milieu Opti-MEM (appelé « tube A »).

4. Ajouter 5 µg d'ADN plasmidique (ARNg ou vecteur tout-en-un) et 10 µl de réactif P3000 à 125 µl de milieu (appelé « tube B »).

5. Mélanger le contenu du tube A et du tube B et incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.

6. Remplacez le milieu de la plaque réceptrice par un milieu sans stylo/strep.

7. Ajouter le mélange de transfection aux cellules receveuses goutte à goutte.

8. Changer le milieu 24 h après la transfection.

9. Confirmer l'efficacité de la transfection en évaluant le marqueur fluorescent sous un microscope à fluorescence. Bien que des efficacités de transfection plus élevées permettront un enrichissement par KO plus facile par FACS, même des taux de transfection faibles vous permettront de poursuivre le protocole.

Expansion clonale de lignées cellulaires knock-out

De multiples approches peuvent être utilisées pour isoler les populations potentielles dérivées de clonage knock-out.

6 : EXPANSION MONOBLOC PAR DILUTION PLACAGE

Après introduction du ou des ARNg par transduction ou transfection, des cellules individuelles doivent être isolées afin de générer des lignées clonales qui peuvent être vérifiées comme des knock-outs complets. Deux méthodes courantes pour cela sont le clonage par dilution et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de cellules individuelles (Protocole alternatif 1). Bien que les deux approches puissent produire des clones dérivés d'une seule cellule, le tri FACS est souvent plus efficace compte tenu de sa capacité à isoler spécifiquement les cellules doublement positives. Cependant, le clonage par dilution est moins cher et peut provoquer moins de stress cellulaire que le tri.

Matériaux

  • Milieu de culture cellulaire approprié
  • Plaques de culture cellulaire standard :
    • Plaques de 10 cm (VWR : réf. 25382-701)
    • Plaques 96 puits à fond plat (VWR : n° cat. 29442-056)
    • Réactifs et équipements supplémentaires pour la culture cellulaire et la trypsinisation (article des protocoles actuels : Phelan, 1996)

    1. Récoltez les cellules transduites par trypsinisation.

    2. Compter les cellules et diluer à une concentration de 20 cellules pour 100 µl.

    3. À l'aide d'une pipette multicanaux, pipeter 200 µl de cellules diluées dans la première rangée d'une plaque à 96 puits.

    4. Pipeter 100 µl du milieu de culture approprié dans tous les puits restants de la plaque.

    5. Prélever 100 µl de la première rangée de la plaque contenant les cellules et les mélanger avec les 100 µl de milieu approprié de la rangée ci-dessous. Cela se traduira par une dilution par deux de la concentration cellulaire pour la deuxième rangée.

    6. Répétez ce processus le long des rangées de la plaque, résultant en une série de dilutions doubles le long des rangées. Cela se traduira par une certaine proportion des puits contenant une seule cellule.

    7. Vérifier par microscopie les puits qui contiennent une seule cellule qui sont simples ou doublement positifs pour le(s) marqueur(s) d'ARNg. Cela peut être fait immédiatement après la dilution ou 12 à 24 heures plus tard, une fois que les cellules se sont installées. Entoure ces puits.

    8. Les puits contenant des cellules individuelles doivent être agrandis : laisser les cellules se développer pour former des microcolonies (∼50-100 cellules). Divisez la microcolonie dans un puits frais d'une plaque à 96 puits. Une fois que ce puits est proche de la confluence, divisez-le en un puits d'une plaque à 48 puits. Continuez à étendre la ligne jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de cellules puisse être récolté pour les tests de validation décrits ci-dessous.

    1 : ISOLEMENT ET EXPANSION MONO-CELLULAIRE PAR FACS

    FACS peut être utilisé de plusieurs manières pour isoler des cellules individuelles. Lors de l'utilisation de l'approche à deux ARNg, FACS peut être utilisé pour isoler les cellules qui expriment les deux ARNg en triant les deux marqueurs fluorescents. Selon votre choix de système et la configuration de votre installation FACS, il existe plusieurs approches pour cela, énumérées ci-dessous.

    1. Les cellules individuelles doublement positives peuvent être triées directement par FACS et étalées dans des plaques à 96 puits.

    2. Les populations en vrac de cellules doublement positives peuvent être isolées par FACS et étalées dans des plaques à 96 puits par étalement de dilution, comme décrit dans le protocole de base 6.

    1. Plaque 100-200 cellules de l'échantillon trié par FACS de cellules doublement positives sur une plaque de 10 cm.
    2. Utilisez un microscope pour identifier les microcolonies isolées qui commencent à se développer.

    Utilisez des cylindres de clonage (Chemglass cat. no. CLS-1777-02) pour isoler et trypsiniser les microcolonies individuelles, puis les déplacer vers une plaque à 96 ou 48 puits pour l'expansion clonale.

    Les clones peuvent être étendus par placage sur des plaques de plus en plus grandes jusqu'à ce qu'il y ait suffisamment de cellules pour congeler et prélever de l'ADN et des lysats de protéines pour la vérification du knock-out.

    Validation de Gene Knockout

    La pierre angulaire de toute stratégie pour vérifier qu'une protéine d'intérêt a été enlevée est la démonstration de son absence par analyse de transfert de Western.Cependant, les Western blots uniques peuvent être trompeurs, et la caractérisation des altérations précises causées par CRISPR au niveau de l'ADN peut fournir des informations utiles supplémentaires. Les options de validation par knock-out diffèrent également légèrement selon que l'approche à un guide ou à deux guides a été utilisée. En particulier, si un gène a été ciblé par deux ARN guides indépendants, une stratégie de criblage basée sur la PCR peut être appliquée pour évaluer rapidement le statut knock-out de dizaines de clones potentiels. Alternativement, la présence de mutations indel peut être vérifiée sur chaque site coupé, bien que cela devienne plus difficile si les mutations résultantes sont hétérozygotes. Aucune technique n'est parfaite et nous recommandons aux chercheurs d'appliquer une combinaison des méthodes décrites ci-dessous pour caractériser les lésions induites par CRISPR et identifier des clones knock-out valides. Les figures 2 et 3 montrent les résultats représentatifs de différentes expériences de validation pour confirmer l'inactivation de la kinase MELK à partir de lignées cellulaires cancéreuses (Giuliano, Lin, Smith, Palladino, & Sheltzer, 2018 Lin, Giuliano, Sayles, & Sheltzer, 2017).

    4: EXTRACTION D'ADN GÉNOMIQUE À PARTIR DE CELLULES KO POTENTIELLES

    Pour confirmer le knock-out du gène par PCR (Basic Protocol 7), séquençage des mutations (Basic Protocol 8) ou clonage TOPO (Basic Protocol 9), l'ADN génomique doit d'abord être préparé à partir de lignées cellulaires de contrôle et de knock-out potentielles.

    Matériaux

    • Cellules knock-out potentielles
    • DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen réf. 69506)
    • Matériaux de culture cellulaire
    • Plaques de culture tissulaire 6 puits
    • Tubes de 15 ml
    • Tube de microcentrifugation de 1,5 ml
    • Spectrophotomètre NanoDrop ou équivalent

    1. Plaque ∼ 300 000 cellules dans un puits d'une plaque à 6 puits pour chaque clone putatif knock-out.

    Si le nombre de clones à cribler est important et que l'ensemencement de 300 000 cellules par clone n'est pas optimal, les cellules peuvent être ensemencées dans des plaques à puits plus petites et les kits QuickExtract peuvent être utilisés à la place des kits DNeasy. Cependant, pour un ADN génomique de haute qualité et des résultats de séquençage propres dans les étapes ultérieures, nous recommandons de plaquer ∼ 300 000 cellules.

    2. Le lendemain, suivez le protocole du fabricant du kit DNeasy Blood & Tissue pour isoler l'ADN génomique.

    3. Quantifier la concentration et la pureté de l'ADN avec un spectrophotomètre NanoDrop. Un rendement en ADN de ∼1 µg est idéal.

    7 : SUPPRESSION GÉNOMIQUE ET PCR CUT-SITE

    Pour dépister les knock-outs génomiques, concevez deux ensembles d'amorces PCR : un qui couvre la délétion putative et un qui couvre l'un ou l'autre des sites coupés. Les amorces doivent reconnaître une séquence d'environ 100 à 200 pb du site de coupure CRISPR, car les séquences plus grandes sont plus difficiles à amplifier. Des amorces appropriées peuvent être conçues à l'aide de NIH Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) et commandées auprès d'IDT (https://www.idtdna.com).

    Matériaux

    • ADN génomique (Support Protocol 4)
    • Amorces
    • Taq 2× Master Mix (NEB réf. M0270)
    • Eau distillée et déminéralisée sans nucléase (ddH2O)
    • Thermocycleur
    • Tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml
    • Réactifs et équipement supplémentaires pour l'électrophorèse sur gel d'agarose (article sur les protocoles actuels : Voytas, 2001)

    1. Pour chaque échantillon d'ADN génomique, configurez une réaction avec des amorces amplifiant un seul site de coupure et une autre réaction avec des amorces couvrant la délétion. Comme contrôles, mettre en place une réaction PCR avec l'ADN génomique d'une population de type sauvage et une réaction PCR avec l'ADN génomique d'une population mixte transduite/transfectée avec les deux guides. Suivez les instructions du fabricant pour effectuer la PCR avec le Taq 2× Master Mix.

    2. Une fois les réactions PCR terminées, exécutez les produits PCR sur un gel d'agarose à 2 %.

    Si la région d'ADN entre les sites coupés était supprimée, alors un produit PCR serait attendu dans les réactions avec les amorces de délétion et non dans les réactions avec les amorces des sites coupés. La présence d'un produit de réaction dans la piste d'amorce du site de coupure indique que toutes les copies du matériel génétique intermédiaire n'ont pas été excisées.

    8 : CARACTÉRISER LES MUTATIONS INDUITES PAR CRISPR PAR SÉQUENÇAGE

    Si le chercheur choisit l'approche knock-out à guide unique, alors la démonstration de la présence d'une mutation indel sur le site de coupure de l'ARN guide est une preuve solide que le gène ciblé a été désactivé. (Notez que cette approche est également appropriée si deux ARNg sont utilisés mais qu'aucune délétion complète n'est détectée.) L'analyse du site de coupure peut être effectuée en amplifiant par PCR la région ciblée par l'ARN guide, puis en soumettant l'amplicon au séquençage de Sanger. Dans le cas où la lésion s'avère hétérozygote, le clonage TOPO peut être appliqué pour séquencer les allèles individuels trouvés dans le clone.

    Pour cette approche, isolez d'abord l'ADN génomique de chaque clone knock-out putatif et concevez des amorces PCR pour amplifier une région de 200 à 400 pb autour du site de coupure, comme décrit ci-dessus. Ensuite, effectuez la PCR et séquencez l'amplicon :

    Matériaux

    • ADN génomique (Support Protocol 4)
    • Amorces
    • 2× Taq Master Mix (NEB réf. M0270)
    • Gel NucleoSpin® et nettoyage PCR (Macherey-Nagel réf. 740609.50)
    • Eau sans nucléase
    • Équipement d'électrophorèse sur gel
    • Thermocycleur
    • Tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml
    • Tube de microcentrifugation de 1,5 ml
    • Réactifs et équipement supplémentaires pour l'électrophorèse sur gel d'agarose (article sur les protocoles actuels : Voytas, 2001)

    1. Pour configurer une réaction PCR, suivez le protocole du fabricant pour les directives de PCR et les réglages du thermocycleur pour le mélange maître 2× Taq. Comme contrôle, mettre en place une réaction PCR en utilisant l'ADN génomique d'une population de type sauvage.

    2. Exécutez le produit PCR sur un gel à 2 %. Vérifiez qu'une bande de la bonne taille est présente.

    3. À l'aide du gel NucleoSpin® et du nettoyage PCR, isolez les fragments PCR du mélange.

    4. Configurez les réactions de séquençage de Sanger conformément aux directives de l'installation de séquençage. Les amorces directes et inverses utilisées pour la PCR peuvent également être utilisées pour le séquençage.

    5. Comparer les séquences entre la population de type sauvage et chaque clone à l'aide d'un logiciel d'analyse de chromatogramme standard. Les indels doivent être observés sur ou à proximité du site ciblé par la nucléase.

    9 : CARACTERISATION DES MUTATIONS HETEROZYGOUSES PAR CLONAGE ET SEQUENCAGE TOPO

    Si le séquençage de Sanger révèle que la lésion induite par CRISPR est hétérozygote (comme en témoigne la présence de bases chevauchantes dans le chromatogramme de la figure 3C), les allèles peuvent être déconvolués par clonage et séquençage TOPO. Tout d'abord, les allèles individuels sont clonés dans le vecteur TOPO et transformés en E. coli. Ensuite, des colonies individuelles sont prélevées et les plasmides sont réisolés par miniprep puis séquencés individuellement. De cette façon, les chercheurs peuvent confirmer la présence de mutations indel dans chaque allèle d'une lignée cellulaire ciblée.

    Notez que la polymérase Taq utilisée pour la PCR dans ce protocole laisse un surplomb d'adénine à l'extrémité 3' du produit PCR. En conséquence, le kit TOPO TA (Thermo Fisher Scientific cat. n° 450071), dans lequel le vecteur contient un surplomb en T, doit être utilisé pour le clonage TOPO de ces amplicons. Si une polymérase différente avec une activité de relecture est utilisée pour la PCR, alors le kit TOPO à bouts francs (réf. 450159) doit être utilisé à la place.

    Matériaux

    • Produits PCR issus de réactions PCR sur site coupé (Protocole de base 8)
    • Kit TOPO™ TA Cloning™ pour Séquençage, sans cellules compétentes (réf. 450071)
    • Stbl3 compétent E. coli cellules (Support Protocol 2)
    • Eau sans nucléase
    • Plaques de culture LB + 50 µg/ml kanamycine
    • Milieu LB + 50 µg/ml kanamycine
    • Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen réf. 27106)
    • Tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml
    • Thermocycleur

    1. Ligaturer les produits de la PCR sur site coupé dans des plasmides TOPO conformément aux directives du fabricant.

    2. Ajouter 2-3 µl du produit de ligature à une aliquote de Stbl3 E. coli cellules. Incuber les cellules sur de la glace pendant 5 min puis plaquer le E. coli cellules sur plaques LB + kanamycine. Laisser pousser les plaques à 37°C pendant la nuit.

    3. Le lendemain, prélever 15 colonies dans les plaques et cultiver chacune d'elles dans 2 ml de milieu LB + kanamycine.

    4. Isoler les plasmides du E. coli cellules à l'aide du kit QIAprep Spin Miniprep.

    5. Configurez les réactions de séquençage de Sanger conformément aux directives de l'installation de séquençage. L'amorce directe ou l'amorce directe M13 du kit de clonage TOPO peut être utilisée pour séquencer les plasmides. Mettre en place une réaction de séquençage en utilisant également le produit PCR de la population de type sauvage.

    6. Analyser les allèles résultants à l'aide d'un logiciel d'analyse de chromatogramme standard. Les indels doivent être observés au niveau ou à proximité du site ciblé par la nucléase.


    RÉSULTATS ET DISCUSSION

    Le système CRISPR-Cas de type I-D est composé de protéines effectrices Cas avec un module nucléase

    Composants des protéines effectrices Cas et de la séquence crRNA de Microcystis aeruginosa ont été évalués à l'aide de BLAST. Le locus CRISPR–Cas de type I-D de 7,6 kb de M. aeruginosa la souche PCC9808 se compose de huit cas gènes (cas1dcas7d, cas10d) suivi d'un tableau de 36 unités d'espacement de répétition (figure 1A et B). Le domaine HD (47) qui fonctionne dans le clivage de l'ADN dans CRISPR de type I-A, B, C, E et F (13, 21, 26, 48-50) fait défaut dans Cas3d. Au lieu de cela, Cas10d, qui appartient à la protéine de la superfamille Cas10, abrite un domaine de nucléase de type HD dans sa région N-terminale (Figure 1C et Figure supplémentaire S1). Cas10—une protéine signature des systèmes CRISPR de type III ( 51, 52)—fonctionne dans la dégradation de l'ADN et de l'ARN ( 53–55). Récemment, un modèle évolutif des systèmes CRISPR a proposé que l'origine de cas10 est un facteur ancestral du système immunitaire procaryote (52). Dans ce modèle, l'ancêtre cas10 Le locus du gène a évolué en un système ancestral de Classe 1, ce système ancestral de Classe 1 étant ensuite divisé en systèmes de type I et de type III. Pendant cette période, l'incorporation de cas3 et la perte de cas10 survenue dans le système typique de type I ( 52). Par conséquent, CRISPR type I-D est un système unique qui possède à la fois des gènes de signature de type I et III, bien que ce sous-type ait été attribué au type I.

    Activité de clivage de l'ADN de CRISPR type I-D. (UNE) Structure I-D de type CRISPR. En haut : locus CRISPR type I-D dans Microcystis aerginosa. En bas (côté gauche) : organisation schématique des sous-unités CRISPR-Cas de type I-D et des crRNA matures (ligne noire), En bas (côté droit) : organisation schématique des sous-unités CRISPR-Cas de type I-E et des crRNA matures (ligne noire). PAM pour le type I-D ou le type I-E est indiqué par une case rouge. (B) Structure des ARNcr prématurés et matures, y compris la répétition et l'espaceur. En haut : séquence d'ARNcr pré-mature. En bas : séquence d'ARNcr mature prédite. La séquence potentielle de tige-boucle reconnue par Cas6d a été soulignée. (C) Alignement des séquences d'acides aminés du domaine HD dans Cas3 et Cas10d. Des alignements multiples ont été générés par ClustalX en utilisant les domaines HD Cas3 de diverses bactéries et un domaine HD Cas10d de M. aeruginosa. Les acides aminés ont été colorés comme paramètre de coloration par défaut du programme CLUSTAL en bleu : acides aminés hydrophobes (A, I, L, M, F, W, V, C) rouge : acides aminés chargés positivement (K, R) magenta : chargés négativement acides aminés (E, D) vert : acides aminés polaires (N, Q, S, T) orange : glycine jaune : proline cyan : acides aminés aromatiques (H, Y). Les astérisques indiquent les acides aminés présents dans toutes les séquences protéiques. L'alignement multiple des séquences complètes de la protéine Cas10d est illustré dans la figure supplémentaire S1. (D–F) Détection de l'activité ssDNA nuclease par in vitro essai. L'ADN simple brin M13mp18 a été utilisé comme substrat. () Étude temporelle de l'activité nucléase ADNsb de Cas10d. Ctrl : réaction de contrôle sans protéines Cas, Cas10d : réaction avec protéine Cas10d, Cas3d : réaction avec protéine Cas3d, flèches rouges ADN non digéré. (E) Dépendance de l'activité nucléase ADNsb sur les concentrations Cas10d. (F) Effet des dications sur l'activité de la nucléase ADNsb Cas10d. Le dosage de l'ADNsb nucléase a été réalisé avec 25 mM d'EDTA ou diverses concentrations de dications (Mg 2+ , Ni 2+ , Co 2+ ). (g) Détection de l'activité dsDNA nuclease par in vitro dosage l'ADN linéarisé a été utilisé comme substrat. Ctrl : réaction de contrôle sans protéines Cas, Cas10d : réaction avec protéine Cas10d, Cas3d : réaction avec protéine Cas3d, flèches rouges ADN non digéré.

    Activité de clivage de l'ADN de CRISPR type I-D. (UNE) Structure I-D de type CRISPR. En haut : locus CRISPR type I-D dans Microcystis aerginosa. En bas (côté gauche) : organisation schématique des sous-unités CRISPR-Cas de type I-D et des crRNA matures (ligne noire), En bas (côté droit) : organisation schématique des sous-unités CRISPR-Cas de type I-E et des crRNA matures (ligne noire). PAM pour le type I-D ou le type I-E est indiqué par une case rouge. (B) Structure des ARNcr prématurés et matures, y compris la répétition et l'espaceur. En haut : séquence d'ARNcr pré-mature. En bas : séquence d'ARNc mature prédite. La séquence potentielle de tige-boucle reconnue par Cas6d a été soulignée. (C) Alignement des séquences d'acides aminés du domaine HD dans Cas3 et Cas10d. Des alignements multiples ont été générés par ClustalX en utilisant les domaines HD Cas3 de diverses bactéries et un domaine HD Cas10d de M. aeruginosa. Les acides aminés ont été colorés comme paramètre de coloration par défaut du programme CLUSTAL en bleu : acides aminés hydrophobes (A, I, L, M, F, W, V, C) rouge : acides aminés chargés positivement (K, R) magenta : chargés négativement acides aminés (E, D) vert : acides aminés polaires (N, Q, S, T) orange : glycine jaune : proline cyan : acides aminés aromatiques (H, Y). Les astérisques indiquent les acides aminés présents dans toutes les séquences protéiques. L'alignement multiple des séquences complètes de la protéine Cas10d est illustré dans la figure supplémentaire S1. (D–F) Détection de l'activité nucléase ADNsb par in vitro essai. L'ADN simple brin M13mp18 a été utilisé comme substrat. () Étude temporelle de l'activité nucléase ADNsb de Cas10d. Ctrl : réaction de contrôle sans protéines Cas, Cas10d : réaction avec protéine Cas10d, Cas3d : réaction avec protéine Cas3d, flèches rouges ADN non digéré. (E) Dépendance de l'activité nucléase ADNsb sur les concentrations Cas10d. (F) Effet des dications sur l'activité de la nucléase ADNsb Cas10d. Le dosage de l'ADNsb nucléase a été réalisé avec 25 mM d'EDTA ou diverses concentrations de dications (Mg 2+ , Ni 2+ , Co 2+ ). (g) Détection de l'activité dsDNA nuclease par in vitro dosage l'ADN linéarisé a été utilisé comme substrat. Ctrl : réaction de contrôle sans protéines Cas, Cas10d : réaction avec protéine Cas10d, Cas3d : réaction avec protéine Cas3d, flèches rouges ADN non digéré.

    Il a été rapporté que Cas3 lui-même a la capacité de dégrader l'ADN simple brin de manière non spécifique (20, 39). Par conséquent, pour confirmer la fonction nucléase de Cas10d, nous avons effectué in vitro dosages de nucléases. Pour ce test, les protéines Cas10d et Cas3d ont d'abord été exprimées et purifiées à partir de cellules humaines HEK293T (figure supplémentaire S2A et B) et identifiées par analyse LC-MS/MS (figure supplémentaire S2C) pour une utilisation dans d'autres tests. La protéine Cas10d, mais pas la protéine Cas3d, a pu cliver les ADNsb de M13mp18 en présence d'ions Mg 2+, Ni 2+ et Co 2+ (figure 1D), suggérant que Cas10d agit comme une nucléase dans le système de type I-D.

    L'activité nucléase dépendante de la concentration Cas10d a également été détectée (figure 1E). Les réactions sans ions métalliques ou avec de l'EDTA n'ont entraîné aucun clivage des ADNsb, suggérant un rôle important des cations divalents dans le clivage de l'ADNsb médié par Cas10d (figure 1F). Nous avons ensuite étudié l'effet de différents cations divalents sur l'activité de clivage de l'ADNsb dans la gamme de concentrations utilisée par Mulepati et Bailey (39) et avons constaté que la présence d'ions Mg 2+ ou Co 2+ ou Ni 2+ stimulait l'activité de clivage de l'ADNsb de Cas10d (Figure 1F). En regardant l'activité nucléase de l'ADN double brin (ADNdb), ni Cas10d ni Cas3d n'ont clivé l'ADNdb en présence d'ions ATP, Mg 2+ , Co 2+ et Ni 2+ (figure 1G). Ces résultats ont indiqué que Cas10d a une activité nucléase spécifique de l'ADNsb, et non de l'ADNdb. Même si E. coli et Streptocoque thermophilus Les protéines Cas3 de type I-E ont également une activité de nucléase d'ADN simple brin, les exigences pour les cations divalents différaient de celles de Cas10d de type I-D (EcCas3 Cu 2+ ou Ni 2+, StCas3 Mg 2+) (20, 39). Ces différences peuvent influencer l'activité d'édition du génome dans les cellules humaines, selon la concentration physiologique de chaque cation divalent à l'intérieur des noyaux humains. Nos résultats suggèrent que Cas10d dans le système de type I-D a des caractéristiques uniques en tant que nucléase distincte des autres protéines Cas3 connues.

    Nous avons ensuite étudié si la protéine Cas10d avait une activité ATPase en incubant Cas10d avec de l'ATP, car nous avons constaté que Cas10d avait des motifs de liaison à l'ATP possibles (figure supplémentaire S1). La quantité de phosphate libérée de l'ATP a augmenté lors de l'incubation avec Cas10d et également en présence d'ADNsb, mais pas d'ADNdb (figure 2A), indiquant que Cas10d a une activité ATPase stimulée par l'ADNsb. Une étude de cours dans le temps a indiqué que le phosphate libéré s'accumulait avec le temps de réaction en présence de Cas10d (figure 2B). La vitesse de réaction a été calculée sur la base de la pente de la ligne droite approximative, résultant en 1,22 min -1 à 2 mM d'ATP, ce qui était inférieur à la vitesse de réaction de StCas3 (38 min -1 à 0,5 mM d'ATP) (20) , suggérant que l'activité ATPase de Cas10d est plus faible que celle de StCas3. Comme la protéine Cas3d contient des motifs de domaine de liaison à l'ATP, nous avons examiné si Cas3d avait également une activité ATPase. Les résultats ont indiqué que la protéine Cas3d présente une faible activité ATPase (figure 2A). Les résultats combinés avec notre étude précédente (37) suggèrent que Cas10d et Cas3d coopèrent pour le clivage de l'ADN cible dans le système de type I-D.

    Activité ATPase et hélicase de Cas10d et Cas3d. (UNE) Dépendance de l'activité ATPase de Cas10d (gauche) et Cas3d (droite) sur la concentration de ssDNA ou dsDNA. Diverses quantités d'ADN ss (M13mp18) ou dsDNA (pNEB193) ont été mélangées avec 700 nM de Cas10d en présence de Co 2+ , Ni 2+ et ATP, et ont réagi à 37 °C pendant 2 heures avant de mesurer le phosphate libre libéré de ATP. Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). (B) Étude temporelle de l'activité ATPase de Cas10d. La réaction a été réalisée avec 700 nM de Cas10d et 3 nM d'ADNsb à 37°C dans le même tampon utilisé dans (A). La vitesse de réaction calculée à partir de la pente de l'évolution temporelle est de 1,22 min -1 . Les expériences ont été répétées trois fois indépendamment. Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). (C) Test hélicase pour Cas3d et Cas10d. Des ADN duplex partiels marqués avec ATTO532 ont été utilisés comme ADNdb dans cette expérience. L'oligo marqué ATTO532 (100 nt) a été utilisé comme ADNsb. Cas10d ou Cas3d ou les deux ont été incubés avec des ADN avec ou sans ATP à 37°C pendant 2 h. Les produits ont été séparés par électrophorèse sur gel non dénaturant et visualisés par Typhoon FLA9500 (Cytiva). Les expériences ont été répétées trois fois indépendamment.

    Activité ATPase et hélicase de Cas10d et Cas3d. (UNE) Dépendance de l'activité ATPase de Cas10d (gauche) et Cas3d (droite) sur la concentration de ssDNA ou dsDNA.Diverses quantités d'ADN ss (M13mp18) ou dsDNA (pNEB193) ont été mélangées avec 700 nM de Cas10d en présence de Co 2+ , Ni 2+ et ATP, et ont réagi à 37 °C pendant 2 heures avant de mesurer le phosphate libre libéré de ATP. Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). (B) Étude temporelle de l'activité ATPase de Cas10d. La réaction a été réalisée avec 700 nM de Cas10d et 3 nM d'ADNsb à 37°C dans le même tampon utilisé dans (A). La vitesse de réaction calculée à partir de la pente de l'évolution temporelle est de 1,22 min -1 . Les expériences ont été répétées trois fois indépendamment. Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). (C) Test hélicase pour Cas3d et Cas10d. Des ADN duplex partiels marqués avec ATTO532 ont été utilisés comme ADNdb dans cette expérience. L'oligo marqué ATTO532 (100 nt) a été utilisé comme ADNsb. Cas10d ou Cas3d ou les deux ont été incubés avec des ADN avec ou sans ATP à 37°C pendant 2 h. Les produits ont été séparés par électrophorèse sur gel non dénaturant et visualisés par Typhoon FLA9500 (Cytiva). Les expériences ont été répétées trois fois indépendamment.

    Pour tester si la protéine Cas10 a une activité hélicase, nous avons effectué le test hélicase en utilisant l'ADN duplex partiel comme substrat. La réaction a été réalisée dans le même tampon utilisé dans le test hélicase StCas3 rapporté dans Sinkunas et al. (20) cependant, la séparation des brins d'ADN par l'activité hélicase Cas10d n'a pas été détectée (figure 2C). La protéine Cas3d et la combinaison de Cas10d et Cas3d ont également été examinées pour l'activité hélicase, cependant, aucune activité hélicase n'a été détectée, indépendamment de la présence ou de l'absence d'ATP (figure 2C). Ces résultats suggèrent que Cas10d et Cas3d dans le système de type I-D n'ont pas d'activité hélicase dans ces conditions.

    Les résultats ci-dessus suggèrent des caractéristiques uniques de Cas10d dans le système de type I-D dans le clivage de l'ADN par rapport à d'autres sous-types de type I. Le typique cas8 gène - l'effecteur commun dans CRISPR de type I-A, B, C, E et F ( 36, 51, 52) - est absent du locus CRISPR-Cas de type I-D de M. aeruginosa, prédisant également différents mécanismes de stabilité du complexe Cascade et d'activité de clivage de l'ADN de type I-D dans les cellules par rapport aux autres sous-types de type I (figure 1A).

    CRISPR-Cas de type I-D est biologiquement actif dans les cellules humaines en tant qu'outil d'édition du génome

    Pour confirmer l'expression des protéines dans des cellules hôtes hétérogènes et la formation complexe de protéines Cas de type I-D, des vecteurs d'expression Cas (figure 3A et figure supplémentaire S4B) pour les cellules de mammifères ont été construits et transfectés dans des cellules HEK293T. La formation complexe de Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d et Cas10d avec l'ARNr dans des cellules humaines a été montrée par un essai déroulant (figure 3B et figure supplémentaire S4A). Les résultats montrent également que l'absence de Cas10d a déstabilisé la liaison de Cas3d au complexe Cascade. L'interaction directe de Cas3d et d'autres protéines Cas a également été étudiée (figures supplémentaires S4 et S5). Cas3d interagissait directement avec Cas10d mais pas avec d'autres protéines Cas. Les interactions étaient indépendantes de l'expression du crRNA. Les résultats suggèrent que Cas10d est nécessaire pour recruter Cas3d dans le complexe Cascade dans le système de type I-D. Dans un autre système de type I, Cas8 interagit avec Cas5/Cas7/crRNA et recrute la protéine Cas3 dans le complexe Cascade. En revanche, le système de type I-D ne contient pas cas8. Nos résultats suggèrent que Cas10d joue un rôle similaire à Cas8 dans le système de type I-D, c'est-à-dire le recrutement de la protéine Cas3d et la formation du complexe Cascade.

    Dosage de co-immunoprécipitation des protéines Cas de type I-D. (UNE) Illustration schématique des vecteurs utilisés pour l'expression de chaque protéine Cas. Les cinq types de vecteurs (Flag-NLS-Cas7d, Myc-bpNLS-Cas5d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-Cas6d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-Cas3d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-CasNLS-10d 6xHis) et l'ARNg (ARNg non cible ou AAVS 70-107, tableau supplémentaire S2 ) ont été transfectés dans des cellules humaines HEK293T. (B) Un essai de co-immunoprécipitation utilisant des lysats cellulaires a été réalisé avec les anticorps décrits sur les figures. Les expériences ont été répétées trois fois indépendamment. L, lysat d'échantillon non transfecté, NC, cinq types de vecteurs ont été introduits sans ARNg, NT, cinq types de vecteurs ont été introduits avec ARNg non cible. AAVS70-07 cinq types de vecteurs ont été introduits avec l'ARNg AAVS GTC70-107.

    Dosage de co-immunoprécipitation des protéines Cas de type I-D. (UNE) Illustration schématique des vecteurs utilisés pour l'expression de chaque protéine Cas. Les cinq types de vecteurs (Flag-NLS-Cas7d, Myc-bpNLS-Cas5d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-Cas6d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-Cas3d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-CasNLS-10d 6xHis) et l'ARNg (ARNg non cible ou AAVS 70-107, tableau supplémentaire S2) ont été transfectés dans des cellules humaines HEK293T. (B) Un essai de co-immunoprécipitation utilisant des lysats cellulaires a été réalisé avec les anticorps décrits sur les figures. Les expériences ont été répétées trois fois indépendamment. L, lysat d'échantillon non transfecté, NC, cinq types de vecteurs ont été introduits sans ARNg, NT, cinq types de vecteurs ont été introduits avec ARNg non cible. AAVS70-07 cinq types de vecteurs ont été introduits avec l'ARNg AAVS GTC70-107.

    L'activité d'édition du génome du complexe CRISPR-Cas de type I-D a ensuite été évaluée à l'aide du système de recombinaison par annelage simple brin (SSA) de la luciférase utilisant la luciférase NanoLuc (56). Nous avons développé un système NanoLUxxUC de type fractionné qui se compose de deux vecteurs : pCAG-nLuxxUC_Block1 et pCAG-nLUxxUC Block2 (Figures supplémentaires S10 et S13). Chaque vecteur contient une partie du NanoLuc gènes contenant un bras homologue de 300 pb et l'humain AAVS1 ou EMX1 fragments de gène contenant le site cible de type I-D suivant, ou suivi par, le bras homologue, respectivement (figure supplémentaire S13 fragments d'ADN cible répertoriés dans le tableau supplémentaire S3). Dans ce système, les DSB sur les sites cibles induits par le système de type I-D peuvent être réparés via une réparation dépendante de l'homologie (HDR) ou la voie de recuit simple brin (SSA), qui induit une recombinaison entre les bras d'homologie. Cette recombinaison récupère une fonction NanoLuc gène, entraînant l'émission de luminescence. Nous avons comparé le rapport Nanoluc/Fluc de l'ARNc testé avec celui de l'ARNc non cible et évalué l'activité d'édition du génome. Une illustration schématique du processus de sélection des ARNr est présentée dans la figure supplémentaire S10.

    Il a été rapporté que la séquence 5'-GTT-3' est utilisée pour CRISPR type I-D PAM dans Synéchocyste sp. PCC 6803 (32). nous avons effectué E. coli criblage négatif à l'aide d'une bibliothèque PAM avec le ccdB système d'expression, et identifié que le type I-D de M. aeruginosa reconnu seulement 5′-GTH-3′ (H = A, C ou T) PAM dans E. coli cellules (37). Nous avons ensuite examiné si GTT est actif en tant que PAM dans les cellules de mammifères et avons également analysé l'activité des PAM GTC et GTA (Figure 4A, ARNcr du tableau supplémentaire S6 répertoriés dans les tableaux supplémentaires S2 et S6). Les ARNcr de type I-D ont été criblés par luc reporter assay, dans lequel les cellules HEK293T ont été transfectées simultanément avec le type I-D cas gènes et ARNr et activités détectés 48 heures après la transfection (figure 4A et tableau supplémentaire S6). Les données ont indiqué que l'expression des protéines Cas de type I-D a conduit à une activité d'édition du génome notablement plus élevée, et que le type I-D CRISPR-Cas préfère le GTT et le GTC PAM au GTA PAM dans les cellules de mammifères.

    Détection de l'édition du génome médiée par CRISPR-Cas de type I-D par luc reporter assay. (UNE) Les vecteurs d'expression Cas et les vecteurs rapporteurs luc hébergeant la séquence cible ont été transfectés dans des cellules HEK293T et un test de clivage par endonucléase a produit une luminescence. Les graphiques montrent la sélection des ARNg pour AAVS et hEMX1 gènes dans le système de type I-D en utilisant le test de rapporteur luc. Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). *P < 0.05, **P < 0.01 et ***P < 0,005 sont déterminés par l'étudiant t essais. (B) Effet sur le domaine HD de Cas10d. Le test luc reporter a été réalisé en utilisant le AAVS GTC_70–107 (+), AAVS GTC_159–196 (+) et les ARNg non cibles. Barres blanches : test luc reporter du système de type I-D avec le Cas10d de type sauvage, barres noires : test luc reporter du système de type I-D avec le dCas10d muté HD (H177A). Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives déterminées par le t essais. *P < 0.05. (Panneau inférieur) Les niveaux d'expression de Cas10 et dCas10d (H177A) détectés par les anticorps pour les balises fusionnées à l'extrémité N- (Myc) ou C- (His). Pour cette expérience, pEFs-Myc-bpNLS-Cas10d ou dCas10d (H177A)-bpNLS-6xHis et pEFs-SV40NLS HA-Cas3d, Strept-Cas5d, Myc-Cas6d ou FLAG-Cas7d ont été utilisés pour la transfection. (C) Effet de la forme d'ARNg sur l'activité d'édition du génome du système de type I-D. Barres blanches : test de rapporteur luc du système de type ID avec un ARNcr avec une structure de répétition-espacement-répétition (ARNcr pré-mature) barres noires : test de rapporteur luc du système de type ID avec un ARNcr avec une structure de répétition d'espacement (ARNc mature) . Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). *P < 0,05 est déterminé par Student's t essais.

    Détection de l'édition du génome médiée par CRISPR-Cas de type I-D par luc reporter assay. (UNE) Les vecteurs d'expression Cas et les vecteurs rapporteurs luc hébergeant la séquence cible ont été transfectés dans des cellules HEK293T et un test de clivage par endonucléase a produit une luminescence. Les graphiques montrent la sélection des ARNg pour AAVS et hEMX1 gènes dans le système de type I-D en utilisant le test de rapporteur luc. Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). *P < 0.05, **P < 0.01 et ***P < 0,005 sont déterminés par l'étudiant t essais. (B) Effet sur le domaine HD de Cas10d. Le test luc reporter a été réalisé en utilisant le AAVS GTC_70–107 (+), AAVS GTC_159–196 (+) et les ARNg non cibles. Barres blanches : test luc reporter du système de type I-D avec le Cas10d de type sauvage, barres noires : test luc reporter du système de type I-D avec le dCas10d muté HD (H177A). Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives déterminées par le t essais. *P < 0.05. (Panneau inférieur) Les niveaux d'expression de Cas10 et dCas10d (H177A) détectés par les anticorps pour les balises fusionnées à l'extrémité N- (Myc) ou C- (His). Pour cette expérience, pEFs-Myc-bpNLS-Cas10d ou dCas10d (H177A)-bpNLS-6xHis et pEFs-SV40NLS HA-Cas3d, Strept-Cas5d, Myc-Cas6d ou FLAG-Cas7d ont été utilisés pour la transfection. (C) Effet de la forme d'ARNg sur l'activité d'édition du génome du système de type I-D. Barres blanches : test de rapporteur luc du système de type ID avec un ARNcr avec une structure de répétition-espacement-répétition (ARNcr pré-mature) barres noires : test de rapporteur luc du système de type ID avec un ARNcr avec une structure de répétition d'espacement (ARNc mature) . Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). *P < 0,05 est déterminé par Student's t essais.

    Cas10d et Cas10d de type sauvage portant une mutation dans le domaine de type HD [Cas10d (H177A)] ont ensuite été testés dans le test de rapporteur de luciférase à l'aide d'ARNg AAVS GTC_70–107(+) et AAVS GTC_159–196(+) (Figure 4B et Tableau supplémentaire S2 ). Les résultats ont indiqué que Cas10d possède en effet une activité nucléase dans le domaine de type HD qui peut être utilisée pour l'édition du génome dans les cellules humaines. Cependant, in vitro Le dosage de l'ADNsb nucléase a indiqué que le Cas10d purifié (H177A) conserve toujours l'activité nucléase de l'ADNsb (figure supplémentaire S3). Ce résultat suggère que le résidu H177 dans Cas10d est important pour l'activité dsDNA nuclease dans les cellules humaines mais pas nécessaire pour l'activité ssDNA nuclease in vitro. Récemment, Lin et al. (34) ont également rapporté les effets des mutations du domaine HD sur l'activité nucléase du Sulfolobus islandicus type système I-D in vitro. Ils ont montré que le complexe Cas I-D reconstruit [SiCas5, SiCas7, traité crRNA de S. islandicus et petites sous-unités (SS), SiCas10 portant des mutations du domaine HD purifiées à partir de E. coli] n'a pas réussi à cliver l'ADNds mais pourrait cliver l'ADNss complémentaire in vitro. Bien que le système de type I-D de M. aeruginosa et que de S. islandicus montre des caractéristiques différentes, par exemple, SiCas10/SS seul ne se lie pas à l'ADN ss, et SiCas7 dans un complexe de squelette catalyse le clivage de l'ADN ss, Cas10d joue le rôle majeur dans la fonction de clivage de l'ADN sur l'ADN cible. D'autres études seront nécessaires pour comprendre plus en détail les mécanismes de clivage de l'ADN par les systèmes de type I-D.

    Cas6 est connu sous le nom d'endoribonucléase et clive les séquences répétées de l'ARNc pré-mature à des positions spécifiques qui contiennent la poignée 3' dérivée de la répétition de l'ARNc mature (5-7, 32). Dans le type I-E, le traitement de la séquence d'ARNr par Cas6e était requis pour l'activité d'édition du génome dans les cellules (24). En revanche, l'ARNc mature traité dans le type I-B a une activité dans les cellules (57). Pour tester si l'ARNc traité dans le système de type I-D a une activité d'édition du génome, nous avons effectué le test de rapporteur luc en utilisant l'ARNcr prématuré et les séquences d'ARNc matures prédites (figure 4C). Nous avons prédit des séquences d'ARNc matures basées sur Shao et al. (6) et la stabilité de la structure secondaire a été analysée à l'aide du serveur Web RNAfold. La structure la plus stable a été prédite comme un ARNc mature. L'analyse du rapporteur luc a indiqué que l'activité d'édition du génome de type I-D nécessitait l'expression d'ARNcr pré-mature plutôt que d'ARNc mature traité (figure 4C). Le traitement du pré-ARNr dans sa forme mature pourrait être important pour l'interaction de l'ARNr avec Cascade et l'activité d'édition fonctionnelle du génome de type I-D dans les cellules, comme dans le système de type I-E.

    Nous avons également évalué l'effet des mutations dans les motifs du domaine de liaison à l'ATP de Cas3d et Cas10d sur l'activité d'édition du génome à l'aide du test de rapporteur luc. Les mutations ont aboli l'activité d'édition du génome du système de type I-D (figure supplémentaire S6). Ces résultats indiquent que l'activité ATPase des protéines Cas3d et Cas10d est nécessaire pour l'édition du génome dans les cellules humaines. Ces résultats suggèrent également que le système de type I-D a un mécanisme unique par rapport aux autres systèmes CRISPR-Cas connus dans lesquels seule la protéine Cas3 a une activité ATPase. Les protéines mutantes Cas3d et Cas10d ont formé le complexe avec d'autres protéines Cas (figure supplémentaire S7), indiquant que l'activité d'édition du génome abolie n'était pas due à l'échec de la formation du complexe.

    Nous avons également évalué les effets de la position et du nombre de signaux de localisation nucléaire (NLS) en utilisant deux types de NLS : monopartite-NLS (SV40NLS) et bipartite-NLS (bpNLS). bpNLS a fonctionné aussi efficacement aux extrémités N-terminale et C-terminale de Cas3d, Cas5d, Cas6d et Cas10d que SV40NLS l'a fait à l'extrémité N-terminale (Figure supplémentaire S8A-C). Au contraire, bpNLS-6xHis attaché à l'extrémité C-terminale de Cas7d a perturbé l'activité d'édition du génome de type I-D ( figure supplémentaire S9 ), bien qu'elle soit fortement exprimée dans le noyau ( figure supplémentaire S8C ). Nous avons émis l'hypothèse que la fonction de Cas7d était affectée par la fusion de 6xHis. Pour tester cette hypothèse, nous avons effectué le test du rapporteur luc avec Cas7d fusionné à 6xHis à l'extrémité N ou à l'extrémité C. Le résultat a indiqué que l'activité d'édition du génome de type I-D était diminuée lorsque Cas7d a fusionné avec 6xHis-tag (Figure supplémentaire S9). Le 6xHis chargé positivement pourrait affecter la fonction Cas7d de la liaison à l'ARN ou de la formation en cascade.

    Effet du nombre et des positions des mésappariements entre les espaceurs et l'ADN cible, et les mutations Cas7d sur l'activité d'édition du génome de type I-D

    Nous avons ensuite exploré l'effet de mésappariement de la séquence d'espacement sur l'activité d'édition du génome à l'aide du test de rapporteur luc (figure 5 et figure supplémentaire S11). Les 23 nucléotides juste à côté du PAM, à l'exception des nucléotides à 1, 6-, 12- et 18-nt en aval de PAM, ont été identifiés comme importants pour l'activité d'édition du génome, cependant, un seul décalage à 24, 25- , 30 ou 35 nt n'ont montré aucun effet sur l'activité d'édition du génome (Figure 5A et B). Des études antérieures ont montré que chaque 6ème nucléotide du protospacer n'est pas engagé dans l'appariement de bases avec le brin d'ADN cible dans le complexe Cascade dans le système de type IE (17, 58), car chaque 6ème nucléotide se lie au domaine du pouce des sous-unités Cas7 dans le complexe des Cascades (18, 59-61). La différence évidente entre le type ID et le type IE était l'effet d'un mésappariement à 1-nt, où l'activité de clivage de l'ADN dans le système de type IE est nettement réduite (24), suggérant que le mode et/ou la position de la liaison ARN-Cas7 peut différer entre les deux systèmes. Dans le système de type I-E, la grande sous-unité Cas8 (Cse1 dans le type I-E) et deux petites sous-unités Cas11 servent à stabiliser l'ensemble de la boucle R (14). La différence structurelle en cascade entre le type I-D et le type I-E pourrait influencer l'effet de décalage de chaque système. Nous avons en outre analysé l'effet du nombre de mésappariements et de la position dans la séquence d'ARNg. L'introduction de deux mésappariements dans la région couverte par les nucléotides 1 à 28 a considérablement réduit l'activité d'édition du génome, à l'exception de la combinaison de mésappariements aux positions 24-nt et 25-nt. Cependant, dans les positions nucléotidiques 29-nt à 35-nt, deux mésappariements avaient moins d'un effet réducteur sur l'activité d'édition du génome (figure 5C). D'autre part, l'introduction de trois mésappariements a complètement aboli l'activité d'édition du génome (figure 5D). Ces résultats mettent en évidence des aspects importants de l'interaction spécifique entre le protospacer et les ADN cibles, et le mécanisme de clivage de l'ADN qui en découle du système CRISPR-Cas de type I-D.

    Détection des effets hors cible de l'édition du génome médiée par CRISPR-Cas de type I-D. (UNE) Illustration schématique de l'hétéroduplex de l'ARNg et de l'ADN cible. (B–D) Évaluation des effets hors cible dans l'ARNg de type I-D. Les nucléotides critiques dans AAVS La séquence d'ARNg GTC_70–107(+) pour l'activité d'édition du génome du système de type I-D a été évaluée à l'aide du test de rapporteur luc dans des cellules humaines HEK293T. Les ARNg ont été conçus pour contenir un seul mésappariement (B) ou deux (C) ou trois () nucléotides de mésappariement. Les nucléotides indiqués par des flèches bleues dans (A), les nucléotides aux positions 6, 12, 18 et 24 nt, affectent faiblement l'activité d'édition du génome de type I-D. Le premier nucléotide (flèche rouge) directement adjacent à PAM a également un faible effet sur l'activité d'édition du génome du système de type I-D. NT : non cible, PC : contrôle positif avec ARNg non muté. Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). *P < 0.05, **P < 0.01 et ***P < 0,005 sont déterminés par l'étudiant t tests et des différences statistiquement significatives par rapport à NT.

    Détection des effets hors cible de l'édition du génome médiée par CRISPR-Cas de type I-D. (UNE) Illustration schématique de l'hétéroduplex de l'ARNg et de l'ADN cible. (B–D) Évaluation des effets hors cible dans l'ARNg de type I-D. Les nucléotides critiques dans AAVS La séquence d'ARNg GTC_70–107(+) pour l'activité d'édition du génome du système de type I-D a été évaluée à l'aide du test de rapporteur luc dans des cellules humaines HEK293T. Les ARNg ont été conçus pour contenir un seul mésappariement (B) ou deux (C) ou trois () nucléotides de mésappariement. Les nucléotides indiqués par des flèches bleues dans (A), les nucléotides aux positions 6, 12, 18 et 24 nt, affectent faiblement l'activité d'édition du génome de type I-D. Le premier nucléotide (flèche rouge) directement adjacent à PAM a également un faible effet sur l'activité d'édition du génome du système de type I-D. NT : non cible, PC : contrôle positif avec ARNg non muté. Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). *P < 0.05, **P < 0.01 et ***P < 0,005 sont déterminés par l'étudiant t tests et des différences statistiquement significatives par rapport à NT.

    Nous nous sommes ensuite concentrés sur les interactions entre l'ARNcr, l'ADN cible et la protéine effectrice Cas de type I-D, en particulier la protéine Cas7d qui se lie à l'ARNcr et forme un squelette hélicoïdal dans le complexe Cascade de type I-E (14, 58). Des simulations MD des modèles Cas7e de type I-E, Cas7f de type I-F et Cas7d de type I-D, y compris l'ARNc et l'ADN, ont d'abord été réalisées (Figure 6A-C et Films supplémentaires S1-S3). L'examen de la structure cristalline ainsi que les analyses biochimiques ont suggéré que K45 et R46 dans Cas7e, et Q326 et K327 dans Cas7f sont importants dans la formation du complexe avec Cascade et l'ADN cible (14, 43). La comparaison de ces modèles a suggéré que les trois résidus d'acides aminés (K67, R68 et K69) dans ??-les régions hélicoïdales sont importantes pour l'interaction entre Cas7d, crRNA et l'ADN cible (Figure 6A-C). Pour évaluer le rôle de ces acides aminés dans la formation de complexes, nous avons conçu 12 types de mutants Cas7d [Cas7d (K58A), Cas7d (R62A), Cas7d (K67A), Cas7d (R68A), Cas7d (K69A), Cas7d (R75A), Cas7d (E148Q), Cas7d (K67S/R68Q), Cas7d (K67A/R68A), Cas7d (F66K/K67S/R68Q), Cas7d (F66R/K67A/R68M/K69R), Cas7d (K67S/R68Q/K69Q)] (Figure 6D) et ensuite étudié les effets de ces mutations sur l'activité d'édition du génome de type ID. Le test du rapporteur luc a indiqué que Cas7d (K58A) n'affectait pas l'activité d'édition du génome, mais d'autres types de mutations ont aboli l'activité, suggérant que ces résidus d'acides aminés dans Cas7d sont importants pour l'édition du génome à l'aide du système de type ID CRISPR-Cas (Figure 6E et F ). Pour étudier le mécanisme à l'origine de la perte d'activité chez les mutants Cas7d, nous avons effectué des tests de co-immunoprécipitation en utilisant des mutants Cas7d et d'autres protéines CRISPR-Cas de type I-D avec ou sans crRNA. Les résultats ont indiqué que le mécanisme sous-jacent à la perte d'activité différait en fonction du mutant Cas7d utilisé (figure supplémentaire S12). Cas7d (K67A), Cas7d (E148Q), Cas7d (F66K/K67S/R68Q) n'ont pas affecté la liaison de Cas7d au complexe. Cela suggère que la perte de l'activité d'édition du génome a été causée par des facteurs autres que la formation de complexes. D'autre part, d'autres mutants Cas7d ont provoqué la diminution de la protéine Cas7d liée au complexe, suggérant que la formation de complexe était altérée chez ces mutants. Xue et al. (62) ont également indiqué que certaines mutations Cas7d ont causé la perte de liaison à l'ADNdb in vitro, et que cela n'était pas dû à des défauts de formation du complexe. D'autres études seront nécessaires pour élucider les mécanismes sous-jacents à la perte d'activité de ces mutants Cas7d.

    Effet des mutations Cas7d sur l'édition du génome médiée par CRISPR-Cas de type I-D. (A–C) Instantané de la trajectoire de simulation MD de la cascade de Type I-E (UNE), Type I-F (B) et Type I-D (C) système. Un ruban opaque, un ruban rouge translucide avec une boule et un bâtonnet et un ruban bleu translucide montrent l'une des molécules Cas7e (A), Cas7f (B) ou Cas7d (C), l'ARNr et l'ADN, respectivement. La boule et le bâton indiquent l'épine dorsale de l'ARNc. Les résidus essentiels qui interagissent avec l'ARNr, c'est-à-dire K45, R46 et R49 de Cas7e (A), Q326 et K327 de Cas7f (B), et K67, R68 et K69 de Cas7d (C), sont représentés par des modèles de remplissage d'espace. (D) Séquences d'acides aminés Cas7d et les mutations introduites dans cette expérience. (E, F) Luc reporter dosage de mutants uniques (E) et des mutants doubles, triples et quadruples (F). Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). *P < 0,05 est déterminé par Student's t essais.

    Effet des mutations Cas7d sur l'édition du génome médiée par CRISPR-Cas de type I-D. (A–C) Instantané de la trajectoire de simulation MD de la cascade de Type I-E (UNE), Type I-F (B) et Type I-D (C) système. Un ruban opaque, un ruban rouge translucide avec une boule et un bâtonnet et un ruban bleu translucide montrent l'une des molécules Cas7e (A), Cas7f (B) ou Cas7d (C), l'ARNr et l'ADN, respectivement. La boule et le bâton indiquent l'épine dorsale de l'ARNc. Les résidus essentiels qui interagissent avec l'ARNr, c'est-à-dire K45, R46 et R49 de Cas7e (A), Q326 et K327 de Cas7f (B), et K67, R68 et K69 de Cas7d (C), sont représentés par des modèles de remplissage d'espace. (D) Séquences d'acides aminés Cas7d et les mutations introduites dans cette expérience. (E, F) Luc reporter dosage de mutants uniques (E) et des mutants doubles, triples et quadruples (F). Les données sont des moyennes ± S.E. d'expériences indépendantes (m = 3). *P < 0,05 est déterminé par Student's t essais.

    Ces résultats mettent en évidence des aspects importants de l'interaction dans le type I-D Cas7d, l'ARNr et l'ADN cible. Cependant, d'autres études, y compris l'analyse structurelle du complexe Cas de type I-D, sont nécessaires pour comprendre les détails les plus fins du système.

    Mutagenèse ciblée par système CRISPR-Cas de type I-D dans les cellules HEK293

    Nous avons ensuite ciblé une région d'ADN génomique interne correspondant à la cible d'ARNcr de type I-D pour détecter la mutagenèse induite de type I-D chez les mammifères. Nous avons construit des vecteurs d'expression uniques pour chaque cas gène, un vecteur contenant une cassette d'expression génique triple connectée via une séquence peptidique d'auto-clivage 2A (2A), et un vecteur contenant une cassette d'expression génique quintuple connectée via 2A (figures supplémentaires S8A et S12). De toutes ces configurations, la transfection avec le seul cas les vecteurs d'expression génique ont donné les niveaux d'expression de protéine Cas les plus élevés dans les cellules humaines (Figure supplémentaire S8D). L'expression de Cas5 était plutôt faible mais cela pourrait être résolu en exprimant à partir du plasmide pCAG en utilisant le CAG promoteur, qui est un puissant promoteur synthétique (63) (Figure supplémentaire S8E). Un deuxième cycle d'optimisation des codons serait également une option pour améliorer l'expression de Cas5, comme l'a rapporté Pickar-Oliver et al. ( 27).

    À la suite d'une récente étude d'édition du génome à l'aide de CRISPR-Cas de type I-E (23, 24), nous avons émis l'hypothèse que la délétion à longue distance pourrait être introduite près du site cible de type I-D. Pour étudier cela, nous avons sélectionné des cibles hEMX1 GTT_998–1036 (–) pour l'humain EMX1 gène et AAVS GTC_70–107(+) pour le AAVS gène basé sur le dosage de la luciférase SSA (Figure 4A et B). En utilisant plusieurs jeux d'amorces flanquant de 3 à 15 kpb autour du AAVS et hEMX1 sites cibles et aussi plus de 19 kbp autour du AAVS site cible (Figure 7A et B), des fragments d'ADN amplifiés par PCR à partir d'ADN total provenant de cellules HEK293T transfectées avec les composants de type I-D CRISPR-Cas ont été clonés. Le séquençage a révélé que le type I-D CRISPR-Cas introduisait des délétions à longue portée allant de 2,5 kb à plus de 19 kb sur les sites cibles (figure 7A-C, tableaux supplémentaires S7 et S8). AAVS Les séquences mutées GTC_70–107(+) partageaient certaines caractéristiques spécifiques : la taille des délétions majeures à longue distance n'était pas aléatoire mais présentait certaines restrictions dans le cas de la cible AAVS GTC_70–107(+) en tant que suppressions de 5,2 à 5,5 kb et de 17 à 18 kb avec quelques exceptions mineures, principalement des suppressions bidirectionnelles ont été détectées (Figure 7A-C, tableaux supplémentaires S7 et S8). Ces caractéristiques différaient de celles qui ont suivi la mutation par les effecteurs de type I-E (23, 24) et de type II tels que Cas9 (1, 2) et Cas12a (3). La microhomologie et les insertions ont également été observées dans les sites de mutation (figure 7A-C, tableaux supplémentaires S7 et S8). Les taux de mutation pour la délétion à longue distance dans les fragments d'ADN clonés étaient de 55,0 % et de 57,1 % avec hEMX1 GTT_998–1036 (–) et AAVS GTC_70–107(+), respectivement. De plus, la distribution des mutations dans les produits de PCR clonés variait entre les mutations cibles par hEMX1 998-1036 (–) ont montré une faible mosaïque, alors que les mutations par AAVS GTC_70-107(+) a montré des séquences mutées plus variées (Figure 7A-C et Tableau supplémentaire S7). Les séquences détaillées des fragments PCR dérivés de mutations par délétion longue sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S9.

    Le type I-D CRISPR-Cas médie l'édition du génome dans les cellules humaines. (UN B) Détection de mutations de délétion à longue distance dans le EMX1 et AAVS gènes induits par le type I-D CRISPR–Cas. En haut : structure du gène et divers jeux d'amorces pour amplifier la mutation (flèches). Les ensembles d'amorces pour hEMX1 amplifient respectivement 14 915 pb (ensemble d'amorces 1) et 9 109 pb (ensemble d'amorces 2). Les ensembles d'amorces pour AAVS locus amplifie 19031 pb (Primer set 1), 16624 pb (Primer set 2), 12659 pb (Primer set 3), 10482 pb (Primer set 4), 9246 pb (Primer set 5), 8359 pb (Primer set 6), 7077 pb (ensemble d'amorces 7), 4764 pb (ensemble d'amorces 8), 3594 pb (ensemble d'amorces 9), respectivement. En bas (gauche) : Les fragments amplifiés par PCR ont été séparés sur des gels d'agarose. Ctrl indique les échantillons co-transfectés avec des vecteurs d'expression Cas de type I-D avec un vecteur gRNA non cible. Les nombres correspondent aux ensembles d'amorces indiqués avec les structures des gènes. En bas (à droite) Les grandes mutations de délétion analysées par le séquençage Sanger de l'ADN cloné des cellules infectées de type I-D Cas. Les lignes pointillées indiquent les jonctions suppression/réparation. Les distances nucléotidiques du PAM ont été indiquées sur la séquence. Les tailles des suppressions sont indiquées entre parenthèses. Les séquences soulignées d'une barre orange indiquent la microhomologie trouvée dans les jonctions. (C) Modèle de délétion à longue distance induit par AAVS GTC_70–107 (+). Barre bleue : suppression dans le 5' en amont du PAM, barre rouge : suppression dans le 3' en aval du PAM. L'axe des x indique la distance du site PAM (kbp). La région en amont a été appelée (–), la région en aval est appelée (+). La distribution de la mutation par délétion plus longue est illustrée dans la figure supplémentaire S4C. () Test de mobilité hétéroduplex de la mutation dans le hEMX1 gène induit par le type I-D CRISPR–Cas. Plusieurs pics hétéroduplex (flèches rouges) ont été détectés dans les amplicons PCR des cellules HEK293T infectées par le type I-D CRISPR-Cas qui cible hEMX1 gène [EMX1 998-1036 (–)]. flèche bleue Pic de type sauvage. EV : les cellules infectées par le vecteur vide. M : marqueurs internes. (E) Séquences de mutation dans les cellules HEK293T transfectées avec le type I-D CRISPR–Cas qui ciblent hEMX gène. WT : séquences de type sauvage. Deux ARNg pour CRISPR de type I-D [EMX1_943–981(+) et 998–1036(–)] ont été infectés séparément aux cellules HEK293T. Les séquences cibles d'ARNg sont indiquées dans les cases vertes et PAM est indiquée dans les cases roses. Les fréquences de séquence dans les produits PCR clonés sont indiquées à droite de la séquence. (F) Analyse de l'effet hors cible du type I-D dans les cellules humaines. Les sites hors cible ont été sélectionnés en fonction du nombre de mésappariements (hors cible-1, -2 et -3 pour l'AAVS GTC_70-107) et les délétions longues ont été étudiées par une longue analyse PCR. Les tailles attendues des fragments amplifiés ont été indiquées au sommet des gels.

    Le type I-D CRISPR-Cas médie l'édition du génome dans les cellules humaines. (UN B) Détection de mutations de délétion à longue distance dans le EMX1 et AAVS gènes induits par le type I-D CRISPR–Cas. En haut : structure du gène et divers jeux d'amorces pour amplifier la mutation (flèches). Les ensembles d'amorces pour hEMX1 le gène amplifie respectivement 14 915 pb (ensemble d'amorces 1) et 9 109 pb (ensemble d'amorces 2). Les ensembles d'amorces pour AAVS locus amplifie 19031 pb (Primer set 1), 16624 pb (Primer set 2), 12659 pb (Primer set 3), 10482 pb (Primer set 4), 9246 pb (Primer set 5), 8359 pb (Primer set 6), 7077 pb (ensemble d'amorces 7), 4764 pb (ensemble d'amorces 8), 3594 pb (ensemble d'amorces 9), respectivement. En bas (gauche) : Les fragments amplifiés par PCR ont été séparés sur des gels d'agarose. Ctrl indique les échantillons co-transfectés avec des vecteurs d'expression Cas de type I-D avec un vecteur gRNA non cible. Les nombres correspondent aux ensembles d'amorces indiqués avec les structures des gènes. En bas (à droite) Les grandes mutations de délétion analysées par le séquençage Sanger de l'ADN cloné des cellules infectées de type I-D Cas. Les lignes pointillées indiquent les jonctions suppression/réparation. Les distances nucléotidiques du PAM ont été indiquées sur la séquence. Les tailles des suppressions sont indiquées entre parenthèses. Les séquences soulignées d'une barre orange indiquent la microhomologie trouvée dans les jonctions. (C) Modèle de délétion à longue distance induit par AAVS GTC_70–107 (+). Barre bleue : suppression dans le 5' en amont du PAM, barre rouge : suppression dans le 3' en aval du PAM. L'axe des x indique la distance du site PAM (kbp). La région en amont a été appelée (–), la région en aval est appelée (+). La distribution de la mutation par délétion plus longue est illustrée dans la figure supplémentaire S4C. () Test de mobilité hétéroduplex de la mutation dans le hEMX1 gène induit par le type I-D CRISPR–Cas. Plusieurs pics hétéroduplex (flèches rouges) ont été détectés dans les amplicons PCR des cellules HEK293T infectées par le type I-D CRISPR-Cas qui cible hEMX1 gène [EMX1 998-1036 (–)]. flèche bleue Pic de type sauvage. EV : les cellules infectées par le vecteur vide. M : marqueurs internes. (E) Séquences de mutation dans les cellules HEK293T transfectées avec le type I-D CRISPR–Cas qui ciblent hEMX gène. WT : séquences de type sauvage. Deux ARNg pour CRISPR de type I-D [EMX1_943–981(+) et 998–1036(–)] ont été infectés séparément aux cellules HEK293T. Les séquences cibles d'ARNg sont indiquées dans les cases vertes et PAM est indiquée dans les cases roses. Les fréquences de séquence dans les produits PCR clonés sont indiquées à droite de la séquence. (F) Analyse de l'effet hors cible du type I-D dans les cellules humaines. Les sites hors cible ont été sélectionnés sur la base du nombre de mésappariements (hors cible-1, -2 et -3 pour AAVS GTC_70-107) et les délétions longues ont été étudiées par une longue analyse PCR. Les tailles attendues des fragments amplifiés ont été indiquées au sommet des gels.

    Le test de la luciférase SSA, avec un fragment court (300-500 pb) couvrant deux régions homologues du gène de la luciférase, a clairement montré l'activité d'édition du génome du type ID CRISPR-Cas, nous avons donc demandé si, comme Cas9 et Cas12a, le type Le système d'identification pourrait également introduire de petits changements sur le site cible. Pour tester cela, la région cible de 300 à 500 pb a été amplifiée par PCR et analysée par HMA. Des pics HMA hétéroduplex multiples typiques ont été détectés dans des amplicons PCR de cellules HEK293FT transfectées avec le type I-D CRISPR-Cas avec hEMX1 GTT_998–1036 (–) ARNg (Figure 7D). Analyse de séquence de produits PCR clonés à partir de cellules HEK293FT transfectées avec des ARNg hEMX1 GTT_943–981 (+) et hEMX1 GTT_998–1036 (–) a montré que l'ARNg couplé à des protéines CRISPR–Cas de type I-D pouvait introduire des cassures double brin (DSB) et de petits indels sur le site cible à des taux de mutation de 19,6 % [hEMX1 GTT_943–981 (+)] et 12,5 % [hEMX1 GTT_998–1036 (–)] dans les ADN clonés (Figure 7E).

    Récemment, Dolan et al. (23) et Morisaka et al. ( 24) ont rapporté que le système CRISPR-Cas3 de type I-E induisait de grandes délétions. Morisaka et al. ( 24) ont étudié les mutations avec une efficacité de 16,1% pour le EMX1 gène et 4,6% pour le CCR5 gène dans les cellules HET293T, tandis que les indels médiés par SpyCas9 étaient de 23,4% pour EMX1 et 23,7% pour CCR5. Dolan et al. (23) ont montré l'efficacité des mutations de 13% pour le GFP gène dans les cellules CSEh. Les deux études ont indiqué que le type I-E CRISPR-Cas3 induisait des suppressions à longue distance sur une longue étendue de la région cible, principalement en amont du site PAM/cible, sans points terminaux définis. Morisaka et al. ( 24) ont rapporté que 86,3 % et 81,6 % des suppressions dépassaient 10 ko pour le EMX1 et CCR5 gènes, respectivement, et la taille de la délétion atteignait 78 kb. Dans l'étude de Dolan et al. ( 23), la plupart des délétions étaient concentrées à moins de 30 kb et les tailles de délétion allaient de quelques centaines de pb à 100 kb. D'autre part, le type I-D a produit des résultats d'édition différents par rapport au système de type I-E, le type I-D peut induire à la fois de petits indels et des suppressions bidirectionnelles à longue portée.

    Certaines études ont rapporté que les mutations hors cadre induites par CRISPR-Cas9 entraînent la production d'ARNm ou de protéines aberrantes (64, 65). La capacité d'induire des délétions à longue distance est utile pour éliminer un gène d'intérêt en supprimant toute la région abritant le gène. Il pourrait également être utile d'induire des délétions dans des régions non codantes telles que des promoteurs, des UTR, des introns et des séquences répétitives. Morisaka et al. ( 24) ont indiqué que le système de type I-E peut induire un saut d'exon plus efficacement que le système CRISPR-Cas9. On peut s'attendre à ce que le système de type I-D soit également utilisé à cette fin. Un développement ultérieur pour contrôler les mutations et augmenter l'efficacité devrait étendre l'applicabilité de cette technologie. L'ingénierie des protéines Cas ou des protéines fonctionnelles de fusion, et l'application de la protéine anti-Cas contribueront au développement de cette technologie.

    La différence significative entre le système CRISPR-Cas3 de type I-E et notre système de type I-D est que CRISPR-Cas3 n'induit qu'une délétion longue unidirectionnelle, mais le système de type I-D induit une délétion bidirectionnelle à longue distance ainsi que de petits indels. De petits indels pourraient être le résultat d'une faible activité d'hélicase dans le système de type I-D. La capacité d'induire de petits indels peut être appliquée pour la mutagenèse, telle que celle réalisée à l'aide de CRISPR-Cas9 ou Cas12a. Bien que cette étude ait montré que le système de type ID peut introduire une grande variété de mutations dans la cible, il est difficile de calculer avec précision l'efficacité de la mutation du type ID, qui présente des profils de mutation divers et complexes avec des délétions bidirectionnelles à longue portée et indels courts. Pour caractériser en profondeur l'efficacité de la mutation médiée par le système d'identification de type et la comparer à celles d'autres outils, une nouvelle approche basée sur le séquençage de nouvelle génération devrait être établie pour détecter et analyser la variété des deux suppressions bidirectionnelles à longue distance. et indels courts.

    Nous avons également analysé si des mutations hors cible se sont produites dans des échantillons modifiés par le génome par analyse PCR à longue portée.Comme les sites potentiels hors cible avec moins de 8 mésappariements n'ont pas été trouvés pour AAVS GTC_70-107, nous avons évalué trois sites potentiels avec 9 et 10 mésappariements (tableau supplémentaire S10) par PCR à longue distance. Le résultat a montré que les mutations hors cible n'étaient pas induites par le système de type I-D (figure 7F). Cela pourrait être attribué à la reconnaissance de séquences cibles plus longues par type I-D que Cas9. Bien qu'une analyse plus poussée des mutations hors cible soit nécessaire, les résultats suggèrent que le système de type I-D est un système d'édition du génome utile avec une spécificité élevée, et une ingénierie plus poussée de l'ARNr pourrait augmenter la spécificité du système de type I-D.


    Qu'est-ce que la transfection d'ADN ?

    La transfection de l'ADN est le processus par lequel l'ADN est absorbé par les cellules eucaryotes. Alors que l'application de la transformation bactérienne est généralement destinée à la surexpression de gènes dans le but de produire de grandes quantités de protéines pouvant être purifiées et étudiées, la transfection d'ADN est généralement utilisée pour étudier l'effet de l'expression génique dans un contexte cellulaire. Dans la transfection d'ADN, l'ADN introduit dans la cellule peut être exprimé sur un plasmide extrachromosomique (appelé transfection transitoire), ou intégré dans le génome cellulaire (appelé transfection stable). La transfection transitoire est bénéfique pour un niveau d'expression élevé, en raison de la présence de plusieurs copies de la cassette du gène et d'une analyse rapide (dans les 24 à 96 heures). Une transfection stable est avantageuse pour les études à long terme de l'expression génique dans le contexte cellulaire. Les méthodes de transfection sont conçues pour surmonter les forces répulsives qui entravent la délivrance de molécules d'ADN ou d'ARN (dont le squelette est chargé négativement) à travers la membrane cellulaire (qui contient également des charges négatives). Les méthodes de transfection comprennent généralement le mélange d'acides nucléiques avec des réactifs chargés positivement qui neutralisent les charges négatives du squelette d'ADN ou d'ARN. Le mélange est composé de complexes qui traversent plus facilement la membrane cellulaire. Des méthodes physiques telles que l'électroporation et le bombardement de particules peuvent également être utilisées pour la transfection.


    Discussion

    Auparavant, nous avons montré une correction génique ciblée du mutant E. coli Gène de la β-galactosidase contenant une mutation ponctuelle unique par l'oligonucléotide ARN-ADN chimérique et a rapporté une fréquence d'environ 0,1 % par in vitro réaction utilisant des extraits nucléaires et environ 1 % par transfection transitoire.25 En utilisant le même système, nous avons étudié si un oligonucléotide simple brin peut altérer la séquence d'ADN et comparé son efficacité avec l'oligonucléotide ARN-ADN chimérique, dans le in vitro réaction avec des extraits nucléaires ainsi que dans l'épisome et le chromosome des cellules de mammifères. Étonnamment, nous avons constaté que des oligodésoxynucléotides relativement courts provoquaient une correction génétique dans les cellules de mammifères dans une mesure similaire à celle de l'oligonucléotide ARN-ADN chimérique. Fréquence de correction des gènes du in vitro la réaction était d'environ 0,05 % et ne dépendait pas de la longueur ou de la polarité de l'oligonucléotide. Contrairement au in vitro réaction, la fréquence de la correction du gène de l'épisome dépendait fortement de la longueur et de la polarité de l'oligonucléotide et variait de 0,5 % à 1 % dans les cellules CHO-K1. La correction des gènes nécessitait une longueur optimale avec une homologie de 45 nucléotides montrant la fréquence la plus élevée. De plus, un oligonucléotide antisens présentait une fréquence de correction génétique 1000 fois plus élevée qu'un oligonucléotide sens. La correction des gènes chromosomiques a montré une dépendance similaire à la longueur et à la polarité de l'oligonucléotide par rapport à l'épisome, bien qu'elle se produise à une fréquence plus faible, environ 0,1% dans les cellules CHO-K1. Ainsi, les ODN ont provoqué une correction génique spécifique à la séquence, à la longueur et au brin dans l'épisome et le chromosome des cellules de mammifères.

    Les fréquences de correction génétique de l'ADN épisomique étaient beaucoup plus élevées que celles observées dans les extraits nucléaires. Ce résultat a indiqué que certaines protéines pourraient être exclues ou inactivées lors de la préparation d'extraits nucléaires. La fréquence de correction des gènes épisomiques était plus élevée que chromosomique. Les différences pourraient être causées par la structure de la chromatine, qui peut limiter l'accessibilité de l'ADN chromosomique cible. Il se peut que la recombinaison chromosomique soit différente de la recombinaison épisomique, qui s'est avérée se produire par un mécanisme d'hybridation simple brin non conservateur.282930 La correction d'un seul plasmide parmi plusieurs copies de plasmides non corrigés présents dans les cellules transfectées peut entraîner la restauration de β -activité galactosidase (cellules bleues), entraînant une fréquence apparente élevée de ciblage épisomique.

    L'étape initiale de la correction génétique impliquerait un appariement de l'ODN avec la séquence d'ADN homologue par recombinaison, ce qui constituerait un bon point de départ pour l'étude du mécanisme. Pour corréler l'activité de réparation génique avec une telle formation, nous avons effectué la formation de la boucle D dans des conditions similaires où nous avons mesuré l'activité de réparation génique. Nous avons constaté que les protéines nucléaires catalysaient des étendues similaires de la formation de la boucle D entre l'ODN sens ou antisens et l'ADN superhélicoïdal homologue. Ce résultat suggère un appariement de l'ODN avec l'un ou l'autre brin de l'ADN superhélicoïdal homologue et est en accord avec la même in vitro fréquence de correction génétique présentée par les deux ODN. Dans tous les cas, cependant, les désoxyoligonucléotides ont montré une fréquence de correction génétique plus élevée que les oligonucléotides d'ARN de séquence identique. L'activité de réparation des mésappariements était moins efficace dans le duplex ARN-ADN que dans le duplex ADN-ADN.3132 We33 et d'autres3435 ont également constaté qu'une correction à base unique dans l'ADN cible est préférentiellement entraînée par le brin contenant l'ADN mais pas par le Brin contenant de l'ARN de l'oligonucléotide ARN-ADN chimérique. Par conséquent, la fréquence plus élevée de correction génétique présentée par le désoxyoligonucléotide par rapport au ribo-oligonucléotide pourrait être attribuée à l'activité de réparation de l'ADN. La comparaison des mécanismes de réparation par oligonucléotide ARN-ADN chimérique et ODN simple brin sera présentée ailleurs.

    Contrairement au in vitro réaction avec des extraits nucléaires, la correction du gène épisomique ou chromosomique dépendait fortement de la longueur et de la polarité de l'ODN. La formation de boucles D par des extraits nucléaires n'a également montré aucune différence appréciable entre les ODN antisens et sens de différentes longueurs, indiquant une bonne corrélation entre la recombinaison et in vitro activité de correction génétique. Étant donné que les ODN semblent être assez stables et sont restés sous forme de monomère de pleine longueur dans les cellules de mammifères, la fréquence accrue de correction des gènes trouvée dans les ODN plus longs n'est probablement pas due à la stabilité de l'ODN. Par conséquent, la longueur optimale de l'ODN trouvée dans l'épisome et le chromosome suggère que d'autres facteurs, tels que la taille et la structure d'une chromatine transitoirement ouverte, peuvent jouer un rôle dans l'initiation de la recombinaison.

    Pour les cibles épisomiques et chromosomiques, deux ODN de même longueur mais de polarité opposée ont montré une différence drastique dans la fréquence de correction des gènes, ce qui révèle pour la première fois l'effet potentiel de la transcription sur la réparation des gènes par les ODN courts. La transcription a été liée à la réparation préférentielle du brin transcrit et à la stimulation de la recombinaison.36373839 L'action préférentielle de l'ODN antisens pourrait être due à la séparation des brins pendant la transcription, qui provoque l'ouverture de la chromatine permettant une accessibilité accrue au brin non transcrit, tandis que le brin transcrit brin peut être occupé par l'ARN polymérase et les protéines accessoires. L'autre possibilité est que les deux oligonucléotides aient une capacité égale pour la formation d'hétéroduplex, mais qu'une seule orientation entraînera une correction de la séquence d'ADN, en raison de la spécificité de brin du système de réparation des mésappariements.40 Dans ce cas, l'oligonucléotide sens pourrait former un hétéroduplex avec le brin transcrit mais est excisé et éliminé par le système de réparation de l'ADN, qui favorise le brin résident par rapport au brin envahissant, ce qui n'entraîne aucune correction génétique.41 Nous prévoyons de poursuivre le mécanisme du processus de réparation génétique lié à la transcription à l'avenir. Étant donné que les oligonucléotides antisens pourraient potentiellement s'hybrider à l'ARNm et inhiber la production de protéines, il est possible que la fréquence des oligonucléotides antisens soit plus élevée que celle mesurée dans cette étude. Dans la transformation de levure par ODN, le brin sens affectait la cible 50 à 100 fois plus que l'oligonucléotide antisens,21 indépendamment du taux de transcription du gène. À l'heure actuelle, il n'est pas clair pourquoi une telle différence existe entre les cellules de levure et de mammifère.

    Chan et al3 ont montré qu'un ODN bifonctionnel, contenant un domaine en triple hélice et un fragment donneur allant de 40 à 44 nucléotides homologue à l'ADN cible, à l'exception d'un mésappariement, corrigeait une mutation ponctuelle. Dans leur étude, les ODN sens et antisens ont montré une fréquence similaire, qui était inférieure à l'ODN bifonctionnel. Ici, nous avons constaté que la fréquence de correction des gènes de l'ODN simple brin dépendait fortement de la polarité. Les différences entre ces deux études peuvent provenir des différents systèmes de navette et des tests. Par exemple, le supF Le gène utilisé dans l'oligonucléotide bifonctionnel n'a pas été transcrit, tandis que le gène de la -galactosidase utilisé dans cette étude a été transcrit dans les cellules de mammifère. Nous avons également constaté que ni la longueur ni la polarité de l'ODN n'affectaient de manière appréciable la fréquence de correction des gènes dans le in vitro réaction, où le gène de la β-galactosidase n'a pas été transcrit. De plus, Chan et al mesuré la fréquence par transformation de l'ADN épisomique répliqué dans les cellules de mammifères en bactéries, tandis que nous avons mesuré la fréquence par détection directe du gène corrigé de la β-galactosidase exprimé dans les cellules de mammifères. Il est possible que ces facteurs contribuent aux différences trouvées entre les deux études.

    Cette étude rapporte deux résultats surprenants. Premièrement, les oligonucléotides monocaténaires courts sont capables de corriger les gènes d'une ampleur similaire aux corrections obtenues avec un oligonucléotide ARN-ADN chimérique dans le même système. Deuxièmement, il existe une différence frappante dans l'activité de réparation des gènes mesurée par le in vitro réaction avec des extraits nucléaires et in vivo tests, qui comprennent la transfection transitoire et le ciblage chromosomique. Pendant la révision de cet article, Gamper et al42 ont rapporté que l'ODN simple brin corrigeait les mutations ponctuelles et de décalage du cadre de lecture par incubation d'extraits cellulaires HuH7 avec le plasmide codant pour la résistance aux antibiotiques dans E. coli. Leurs résultats sont en accord avec nos découvertes selon lesquelles les oligonucléotides courts monocaténaires sont capables de in vitro correction génétique, obtenue en utilisant différents vecteurs navettes et systèmes de lecture bactériens. Cependant, nous avons comparé la correction des gènes entre in vitro réaction et in vivo tests, car notre vecteur navette est exprimé à la fois dans des cellules de mammifères et bactériennes. Contrairement au in vitro la réaction avec des extraits nucléaires, la correction des gènes épisomiques ou chromosomiques dépendait fortement de la longueur et de la polarité de l'ODN. Par conséquent, la stratégie de réparation des gènes par ODN simple brin dans les cellules de mammifères nécessite la in vivo tests présentés dans cette étude en plus des in vitro réaction. Avec cette découverte, un désoxyoligonucléotide relativement court peut être envisagé pour effectuer un changement spécifique à la séquence dans la séquence cible dans les cellules de mammifère, à une fréquence similaire à celle de l'oligonucléotide ARN-ADN chimérique.


    Protocole de transfection d'ADN

    Un exemple de protocole est répertorié ici pour les expériences de transfection réalisées dans des plaques à 6 puits. Pour effectuer des expériences de transfection dans d'autres plaques de culture cellulaire, multipliez simplement les quantités suggérées par la surface relative de votre plaque. GenScript recommande d'utiliser Lipofectamine 2000 pour toutes les transfections. Il produit constamment une efficacité de transfection élevée et une surexpression élevée des protéines.

    • Cellules adhérentes : Un jour avant la transfection, plaquer 0,25-1 x 10 6 cellules dans 2 ml de milieu de croissance sans antibiotiques par puits afin qu'elles soient à 90-95% confluentes au moment de la transfection.
    • Cellules en suspension : Le jour de la transfection juste avant la préparation des complexes, plaque 1,0 à 3,5 x 10 6 cellules dans 2 ml de milieu de croissance sans antibiotiques par puits.
    • Pour chaque échantillon de transfection, préparez les complexes ADN-Lipofectamine 2000 comme suit :
      • Diluer l'ADN dans 250 l de milieu de sérum réduit Opti-MEM I sans sérum (ou autre milieu sans sérum). Mélangez doucement.
      • Mélanger délicatement Lipofectamine 2000 avant utilisation, puis diluer la quantité appropriée dans 250 µl de Milieu Opti-MEM I (ou autre milieu sans sérum). Mélanger doucement et incuber 5 minutes à température ambiante.
      • Après 5 minutes d'incubation, combiner l'ADN dilué avec la Lipofectamine 2000 diluée (le volume total est de 500 l). Mélanger doucement et incuber 20 minutes à température ambiante pour permettre aux complexes ADN-Lipofectamine 2000 de se former.

      Ajouter les 500 ul de complexes ADN-Lipofectamine 2000 dans chaque puits contenant les cellules et le milieu. Mélanger délicatement en secouant l'assiette d'avant en arrière.
      Incuber les cellules à 37°C dans un CO2 incubateur pendant 24 à 72 heures jusqu'à ce qu'ils soient prêts à tester l'expression du transgène. Il n'est pas nécessaire d'éliminer les complexes ou de changer le milieu, cependant, le milieu de croissance peut être remplacé après 4 à 6 heures sans perte d'activité de transfection.