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Isolement de protéines à partir de cellules de mammifères

Isolement de protéines à partir de cellules de mammifères



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Quel tampon non SDS puis-je utiliser pour isoler les protéines des cellules de mammifères ? La protéine est destinée à tester des complexes de chaînes de transport d'électrons.


Réponse courte - vous devrez utiliser un détergent non ionique. Ceux-ci vont dissoudre les membranes lipidiques mais laisser la plupart des complexes protéiques intacts et de nombreuses protéines sous forme active.

Cependant, il en existe beaucoup et trouver celui qui convient à un travail particulier est un art noir.

L'approche habituelle consiste à commencer avec quelque chose de très utilisé et pas trop cher comme le Triton X-100. Les détergents avec des groupes de tête glycosides sont également largement utilisés mais tendent à être coûteux.


Fondements de l'ingénierie de la biotechnologie

2.32.5 Expression de protéines hétérologues en culture de cellules de mammifères

Les cellules de mammifères sont actuellement l'hôte de choix pour l'expression de protéines eucaryotes hétérologues qui sont complexes, nécessitant un repliement approprié ou un assemblage multimérique, ou nécessitant des PTM «authentiques» de type humain telles qu'une glycosylation appropriée. Pour cette raison, environ 60 à 70 % de tous les produits pharmaceutiques recombinants sont produits dans des cellules de mammifères. La cellule de mammifère la plus couramment utilisée est la cellule immortalisée d'ovaire de hamster chinois (CHO), mais un certain nombre d'autres lignées ont été approuvées pour la production de protéines biopharmaceutiques, notamment le rein de bébé hamster (BHK), le rein d'embryon humain (HEK), le myélome de souris (NS0 ), et les cellules rétiniennes humaines (voir références 16 et 17).

L'approche la plus courante pour générer des lignées cellulaires CHO transformées de manière stable consiste à commencer avec une souche CHO hôte qui est déficiente à la fois dhfr allèles, un gène qui code pour la dihydrofolate réductase (DHFR). Ces cellules CHO sans DHFR nécessitent l'ajout de glycine, d'hypoxanthine et de thymidine (GHT) dans le milieu pour la croissance. Le gène hétérologue et le dhfr gène sont ensuite clonés dans un seul ou dans des vecteurs d'expression mammifères séparés (voir la revue de Yin et al. [2] pour une liste récente de vecteurs disponibles dans le commerce) et transfectés dans la lignée hôte. L'emplacement et le nombre de copies du plasmide intégré varient parmi les cellules transfectées, qui sont sélectionnées sur un milieu sans GHT. En conséquence, le taux de croissance et l'expression de la protéine hétérologue varieront en raison des effets de position et de nombre de copies, de sorte que généralement des centaines de lignées cellulaires transfectées indépendantes sont criblées pour identifier les candidats les plus prometteurs pour le développement et la mise à l'échelle de bioprocédés. Un autre marqueur sélectionnable qui est utilisé est la glutamine synthétase (gs), avec sélection sur milieu sans glutamine. Des lignées à expression plus élevée ont été sélectionnées en ajoutant des produits chimiques qui bloquent l'activité enzymatique de l'enzyme marqueur (le méthotrexate est ajouté pour le système DHFR et la méthionine sulfoximine est ajoutée pour le système GS), car les cellules survivantes sont susceptibles d'avoir des niveaux d'expression plus élevés de la des gènes marqueurs sélectionnables et, vraisemblablement, le gène voisin codant pour le produit d'intérêt.

Un avantage supplémentaire des cellules de mammifères est leur capacité à sécréter des produits protéiques complexes, multimères et correctement repliés, tels que des anticorps. Les cultures de cellules de mammifères sont régulièrement cultivées dans des bioréacteurs en acier inoxydable à grande échelle en tant que cultures en suspension, généralement dans des cultures en lots étendus avec du milieu ajouté soit en semi-continu soit en petits lots, et des protéines hétérologues sont sécrétées dans le bouillon de culture, ce qui facilite la récupération et le traitement en aval. . Étant donné que les cellules de mammifères sont capables de propager des virus de mammifères, la clairance virale est une étape essentielle de la production biothérapeutique, ainsi que l'élimination de l'ADN de la cellule hôte en raison de la contamination potentielle de l'ADN oncogène. Au cours des 20 dernières années, il y a eu des améliorations substantielles de la productivité des protéines hétérologues en utilisant la culture de cellules de mammifères. On estime que les titres de produits ont augmenté de plus de 100 fois, passant de ∼50 mg l -1 au milieu des années 1980 aux niveaux actuels allant jusqu'à 3 à 5 g l -1 [17] . De même, la productivité spécifique a augmenté d'environ 25 fois, passant de 0,006 à 0,15 g l-jour -1 . Ces améliorations sont principalement attribuées à l'amélioration des formulations de milieu, des stratégies d'exploitation des bioprocédés et du contrôle des procédés.

Bien que des progrès significatifs aient été réalisés dans la productivité des cellules CHO, il existe au moins trois défis majeurs : (1) diminution de la production de protéines hétérologues sur de longues périodes/passages multiples, (2) diminution de la productivité à des densités cellulaires élevées, et (3) longs délais nécessaires pour passer du gène au produit. La stabilité de la production de protéines recombinantes est un attribut important pour une ligne de production, même pour un processus de culture par lots commençant avec des cellules d'une banque de cellules de travail, car de multiples passages sont nécessaires dans le train de fermenteur de graines avant d'inoculer le fermenteur de production. Une productivité réduite peut résulter de l'extinction du gène (la dégradation spécifique de l'ARNm produit) ou des modifications apportées par la cellule hôte au transgène. Par exemple, dans les lignées cellulaires recombinantes CHO-DG44, seulement 15 à 20 % des lignées transfectées présentaient un niveau stable de production de protéines au-delà de 6 mois. Ainsi, l'un des objectifs au cours du processus de criblage extensif est d'identifier des cellules présentant des caractéristiques de production stables ainsi qu'un taux de croissance élevé et une productivité élevée du produit. Les stratégies qui ont été utilisées pour minimiser le silençage génique comprennent le choix d'un promoteur approprié et le ciblage du transgène vers des régions spécifiques du chromosome, y compris des éléments d'ADN tels que des régions de fixation d'échafaudage/matrice dans la construction, des éléments antirépresseurs ou des éléments d'ouverture de chromatine omniprésents [16] .

Un autre défi avec la culture de cellules de mammifères est le long temps de développement du processus qui est requis. Les processus de transfert de gènes, de criblage et de développement de processus de bioréacteur pour la culture de cellules de mammifères prennent au moins 12 mois [17] . Récemment, l'expression génique transitoire dans des cultures de cellules de mammifères a été démontrée. Dans ce processus, des cellules de mammifères (CHO ou HEK-293) sont cultivées dans un bioréacteur, et le vecteur recombinant (non viral) est introduit dans les cellules en utilisant une méthode de transfection chimique telle que le phosphate de calcium ou la polyéthylèneimine. Dans des conditions appropriées, la transcription transitoire, la traduction et le traitement post-traductionnel ont lieu dans les cellules hôtes dans un court laps de temps (1 à 14 jours). Bien que les faibles rendements de production de protéines, la reproductibilité et la mise à l'échelle aient été les défis de l'expression génique transitoire dans les cultures cellulaires de mammifères, il s'agit d'une approche prometteuse pour les applications dans lesquelles le délai entre l'identification du gène et le produit est critique. Récemment, en optimisant la méthode de transfection et les vecteurs de gènes, des titres de produits d'anticorps recombinants allant jusqu'à 860 mg l -1 ont été obtenus à l'échelle de 2 l en utilisant l'expression génique transitoire dans des cellules HEK-293 en 14 jours [18] .

En résumé, bien que les cellules de mammifères soient assez efficaces dans leur capacité à produire des protéines hétérologues qui répondent aux spécifications de qualité de produit requises, les processus de culture de cellules de mammifères basés sur des bioréacteurs sont intrinsèquement plus complexes, coûteux et longs à établir.


La protéine myociline pleine longueur est purifiée à partir de cellules de mammifères sous forme de dimère

La myociline (MYOC) est une protéine sécrétée trouvée dans l'humeur aqueuse (AH) humaine et les mutations du gène MYOC sont la mutation la plus courante observée chez les patients atteints de glaucome. L'AH humain analysé dans des conditions non réductrices suggère que le MYOC ne se trouve normalement pas sous une forme monomère, mais qu'il est plutôt principalement dimérique. Bien que MYOC ait été signalé pour la première fois il y a près de 20 ans, un défi technique auquel les chercheurs sont toujours confrontés est l'incapacité d'isoler la protéine MYOC complète à des fins expérimentales. Nous décrivons ici deux méthodes permettant d'isoler des quantités suffisantes de protéine MYOC humaine pleine longueur à partir de cellules de mammifères. Une méthode impliquait l'identification d'une lignée cellulaire (HeLa S3) qui sécrèterait une protéine pleine longueur (15 mg/L) tandis que la seconde méthode impliquait une approche de purification à partir de cellules 293 nécessitant l'identification et la modification d'un site de clivage MYOC interne (Glu214/Leu215 ). Le rendement en protéine MYOC de 293 cellules a été amélioré par mutation de deux cystéines N-terminales MYOC (C47 et C61) en sérines. La chromatographie d'exclusion stérique analytique de notre protéine MYOC pleine longueur purifiée à partir de cellules 293 a indiqué qu'elle est principalement dimère et nous proposons une structure pour le dimère MYOC. Nous espérons qu'en fournissant des méthodes pour obtenir la protéine MYOC, les chercheurs seront en mesure d'utiliser la protéine pour obtenir de nouvelles connaissances sur la biologie MYOC. Le but ultime de la recherche MYOC est de mieux comprendre cette cible afin d'aider le patient porteur d'une mutation MYOC à conserver sa vision et à maintenir sa qualité de vie.

Mots clés: Dimère Humeur aqueuse humaine Structure modélisée Myociline Isolement des protéines Purification des protéines.


RÉACTIFS ET SOLUTIONS

Tampon d'isolement des noyaux 1 (NIM1)

Ce tampon est utilisé pour préparer NIM2, qui est utilisé pour fabriquer HB (étape 2, protocole de base 2). Préparez à l'avance en mélangeant les composants listés ci-dessous et conservez jusqu'à 6 mois à 4°C. Les volumes doivent être ajustés en fonction du nombre d'échantillons en cours de traitement.

Tampon d'isolement des noyaux 1 (NIM1)
Composant Volume (µl) Concentration finale (mM)
pour 1 échantillon
1,5 M de saccharose 625 250
(Sigma-Aldrich, n° cat. S0389)
2M KCl 46.875 25
(Thermo Fisher Scientific, n° cat. AM9640G)
1 MgCl2 18.75 5
(Thermo Fisher Scientific, n° cat. AM9530G)
Tris‧Cl 1 M, pH 8 37.5 10
(Thermo Fisher Scientific, n° cat. AM9855G)
Eau sans nucléase 3021.88
Le total 3750

Tampon d'isolement des noyaux 2 (NIM2)

Ce tampon est utilisé pour préparer HB (étape 2, protocole de base 2). Préparez frais, mélangez les composants énumérés ci-dessous et gardez sur de la glace. Ces nombres sont calculés de manière à ce qu'il y ait un volume de réserve disponible, si nécessaire. Ajustez en fonction du nombre d'échantillons en cours de traitement.

Tampon d'isolement des noyaux 2 (NIM2)
Composant Volume (µl) Concentration finale (mM)
pour 1 échantillon
NIM1 (voir recette) 1246.25
TNT 1 mM 1.25 1 µM
(Thermo Fisher Scientific, n° cat. P2325)
50 × inhibiteur de protéase 25
(Roche, n° cat. 11873580001)
Le total 1250

Tampon d'homogénéisation (HB)

Préparez frais, mélangez les composants énumérés ci-dessous et gardez sur de la glace. Ces nombres sont calculés de manière à ce qu'il y ait un volume de réserve disponible, si nécessaire. Ajustez en fonction du nombre d'échantillons en cours de traitement. Voir le tableau ci-dessous.

Tampon d'homogénéisation
Composant Volume (µl) pour Concentration finale (mM)
1 échantillon
NIM2 (voir recette) 1212.5
40 U/µl de RNaseIn 12.5 0,4 U/µl
(Thermo Fisher Scientific, n° cat. AM2684)
20 U/µl SuperaseIn 12.5 0,2 U/µl
(Invitrogen, n° cat. AM2696)
10% (v/v) Triton X-100 12.5 0.10%
(Sigma-Aldrich, référence T8787-100ML)
Le total 1250

Tampon de stockage (SB)

Préparez frais et gardez sur la glace. Ces nombres sont calculés de manière à ce qu'il y ait un volume de réserve disponible, si nécessaire. Ajustez en fonction du nombre d'échantillons en cours de traitement. Voir le tableau ci-dessous.

Tampon de stockage
Composant Volume (µl) pour Concentration finale (mM)
1 échantillon
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS1× Invitrogen, n° cat. 10010-049) 995
Sérum albumine bovine (BSA Sigma-Aldrich, n° cat. A4503-10G) 40 mg 4%
40 U/µl Protecteur RNaseIn 5 0,2 U/µl
(Sigma-Aldrich, n° cat. 03335402001)
Le total 1000

Production de protéines transmembranaires recombinantes à partir de cellules de mammifères pour des analyses biochimiques et structurelles

Unité de biologie structurale et chimique des protéines membranaires, Division des neurosciences et de la biologie cellulaire et structurale (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Unité de biologie structurale et chimique des protéines membranaires, Division des neurosciences et de la biologie cellulaire et structurale (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Unité de biologie structurale et chimique des protéines membranaires, Division des neurosciences et de la biologie cellulaire et structurale (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Unité de biologie structurale et chimique des protéines membranaires, Division des neurosciences et de la biologie cellulaire et structurale (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Unité de biologie structurale et chimique des protéines membranaires, Division des neurosciences et de la biologie cellulaire et structurale (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Unité de biologie structurale et chimique des protéines membranaires, Division des neurosciences et de la biologie cellulaire et structurale (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Résumé

Les protéines membranaires intégrales eucaryotes sont des composants clés de divers processus biologiques. Parce qu'ils sont impliqués dans de multiples maladies, il est important de comprendre leur mécanisme d'action en élucidant leur structure et leur fonction. Les défis techniques complexes associés à la génération de protéines membranaires recombinantes nuisent gravement à notre capacité à les comprendre à l'aide de méthodes structurelles et biochimiques. Ici, nous fournissons une procédure détaillée pour traiter et atténuer les difficultés impliquées dans la surexpression hétérologue à grande échelle et la purification des protéines membranaires eucaryotes à l'aide de cellules HEK293S GnTi - transduites avec un baculovirus. Deux protéines humaines, hDHHC15 et hPORCN, sont présentées à titre d'exemples, avec des instructions étape par étape pour la transfection transitoire et la génération de baculovirus, suivies d'une surexpression et d'une purification à partir de cellules HEK293S GnTi -. © 2020 Wiley Périodiques LLC.

Protocole de base 1: Expression de protéines à petite échelle dans des cellules HEK293T de mammifères

Protocole de base 2: Génération de baculovirus à partir de cellules Sf9 (insectes)

Protocole alternatif: Méthode sans énumération pour générer P2 stock viral

Protocole de prise en charge 1: Transduction à petite échelle de cellules HEK293T avec P2 baculovirus

Protocole de base 3: Transduction virale à grande échelle de cellules HEK293S GnTi −

Protocole de prise en charge 2: Préparation membranaire à grande échelle à partir de cellules HEK293S GnTi −

Protocole de base 4: Purification à grande échelle de protéines membranaires à partir de cellules HEK293S GnTi −


Purification de l'ADN à partir d'échantillons de mammifères

Une gamme de kits proposés pour isoler l'ADN génomique d'un large éventail d'échantillons de mammifères, y compris les tissus, le sang et la queue de souris.

Les kits OmniPrep&trade Genomic DNA Isolation, OmniPrep&trade for Blood, OmniPrep&trade for Tissue et OmniPrep&trade for Mouse Tail Isolation sont basés sur une technique de précipitation rapide qui utilise des réactifs de précipitation uniques pour isoler l'ADN génomique exempt de protéines et d'ARN.

MegaLong&trade isole les noyaux dans des conditions d'extraction douces et libère l'ADN génomique par digestion des protéines nucléaires avec une protéinase K LongLife&trade hautement active. La digestion est effectuée dans le dispositif de microdialyse unique et breveté Tube-O-DIALYZER&tradea avec une membrane de 0,45 micromètre, qui minimise l'échantillon manipulation qui est l'une des principales raisons de la rupture de l'ADN.

GET&trade DNA Template et GET&trade DNA Template-Mag sont basés sur notre technologie génomique efficace (GET) qui est conçue pour la purification de modèles d'ADN à partir de petits échantillons provenant de divers types d'échantillons. Il est basé sur l'utilisation d'un tampon de lyse génomique hautement efficace pour la lyse des cellules suivie d'une immobilisation d'acides nucléiques sur une colonne de spin en silice ou des billes magnétiques de silice. Ceci est suivi d'étapes de lavage et d'élution pour obtenir un ADN génomique de haute qualité.

OmniTemplate&trade est spécialement conçu pour l'isolement rapide d'une matrice d'ADN dans un seul tube pour l'analyse par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir d'échantillons de tissus de mammifères, de sang et de cultures cellulaires.


WHEY ET POUDRES DE WHEY | Production et utilisations

Isolement et fractionnement des protéines

Contrairement à la précipitation des protéines de lactosérum par traitement thermique dans la fabrication de la lactalbumine, les méthodologies d'isolement et de fractionnement des protéines visent à séparer les protéines du lactosérum sous une forme telle qu'elles restent, dans la mesure du possible, totalement non dénaturées et conservent ainsi leur fonctionnalité. Ces produits (concentrés et isolats de protéines) ont une teneur élevée en protéines et peuvent avoir des propriétés fonctionnelles exceptionnelles d'une valeur considérable pour l'industrie alimentaire.

Les concentrés de protéines contiennent des protéines de lactosérum dans à peu près les mêmes proportions que celles du lactosérum. (Notez que, dans cet article, le terme « concentrés de protéines » est utilisé pour les produits riches en protéines contenant les protéines de lactosérum individuelles dans environ le même rapport que celui présent dans le lactosérum, le terme « concentré de protéines de lactosérum » est utilisé pour ces produits fabriqués par ultrafiltration, et les termes « isolats de protéines » et « fractions de protéines » sont utilisés pour désigner des produits riches en protéines avec un rapport plus élevé d'une protéine particulière que celle présente dans le lactosérum.) Ces concentrés de protéines sont généralement fabriqués à l'aide d'un absorbant non spécifique pour lier les protéines dans le lactosérum, suivi d'une élution des protéines par traitement de l'absorbant avec un éluant spécifique. Les absorbants qui ont été utilisés commercialement comprennent la carboxyméthylcellulose et une gamme d'oxydes minéraux. Bien que ces absorbants soient comparativement non spécifiques, ils peuvent montrer une préférence pour la liaison de protéines particulières dans des conditions définies de pH, de température et de force ionique. Ainsi, ces procédés peuvent être utilisés pour produire des isolats de protéines, par exemple avec un rapport β-lactoglobuline sur α-lactalbumine plus élevé que celui présent dans le lactosérum.

La technologie de fractionnement des protéines se développe également, qui repose sur la séparation de la -lactalbumine de la -lactoglobuline sur la base de leurs différentes solubilités dans des conditions spécifiées de pH, de température et de force ionique. Il est donc possible, par exemple, de séparer par sédimentation la majeure partie de la -lactalbumine du lactosérum en manipulant soigneusement les conditions de traitement. La -lactalbumine qui s'est sédimentée et la protéine soluble résiduelle (principalement la -lactoglobuline) sont comparativement non dénaturées et conservent ainsi leur haute fonctionnalité. Les conditions employées dans ces procédés sont très douces et n'entraînent aucune dénaturation des protéines de lactosérum. Avec de tels procédés, il est donc possible de produire des isolats riches en -lactoglobuline (avec une force de gel extrêmement élevée) et en α-lactalbumine (un produit qui peut avoir un potentiel considérable dans les aliments non allergènes pour nourrissons).


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Systèmes d'extraction de protéines et de tampon de lyse (PE LB™)

Les systèmes Protein Extraction & Lysis Buffer (PE LB&trade) assurent une bonne récupération des protéines, tout en maintenant l'activité biologique des protéines. Les protéines solubilisées conviennent aux dosages enzymatiques, à l'électrophorèse, aux études de repliement, aux études chromatographiques et à de nombreuses autres applications en aval.

Les systèmes PE LB&trade offrent une large sélection de tampons pour la lyse et l'extraction de protéines à partir de bactéries, levures, cellules de mammifères et tissus de mammifères. Les systèmes PE LB&trade sont basés sur une combinaison exclusive d'agents tampons organiques, de détergents non ioniques doux et d'une combinaison de divers sels pour améliorer l'extraction des protéines et maintenir la stabilité des activités biologiques des protéines.

Pour compléter cette famille de tampons de lyse et d'extraction, nous avons optimisé ProteaseArrest TM et Protease-PhosphataseArrest. Ces inhibiteurs de protéase et de phosphatase protégeront vos protéines d'intérêt de la dégradation et sont compatibles avec tous nos tampons de lyse.


Extraction simultanée de protéines et de métabolites de cellules en culture

Une bonne préparation des échantillons fait partie intégrante de toutes les approches omiques et peut avoir un impact considérable sur les résultats d'un grand nombre d'analyses. Étant donné que les approches de recherche en métabolomique et en protéomique fournissent souvent des informations complémentaires, il est souhaitable de disposer d'une procédure de préparation d'échantillons pouvant fournir des informations pour les deux types d'analyses à partir de la même population cellulaire. Ce protocole explique une méthode pour la séparation et l'isolement des métabolites et des protéines du même échantillon biologique, afin d'être utilisé en aval dans les analyses métabolomiques et protéomiques simultanément. De cette façon, deux niveaux différents de régulation biologique peuvent être étudiés dans un seul échantillon, minimisant la variance qui résulterait de plusieurs expériences. Ce protocole peut être utilisé avec des cultures cellulaires adhérentes et en suspension, et l'extraction des métabolites du milieu cellulaire est également détaillée, de sorte que l'absorption cellulaire et la sécrétion de métabolites puissent être quantifiées.

Les avantages de cette technique comprennent : 1.

Peu coûteuse et rapide à réaliser, cette méthode ne nécessite aucun kit.

Peut être utilisé sur toutes les cellules en culture, y compris les lignées cellulaires et les cellules primaires extraites d'organismes vivants.

Une grande variété de techniques d'analyse différentes peut être utilisée, ajoutant une valeur supplémentaire aux données métabolomiques analysées à partir d'un échantillon qui est d'une grande valeur en biologie des systèmes expérimentaux.


Voir la vidéo: Comment le confinement change le cerveau? Effets de lisolation sociale et de la resocialisation (Août 2022).