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L'oscillateur Goodwin expliqué


Bonjour, j'ai lu des articles sur l'oscillateur Goodwin et j'ai trouvé que les équations sont un peu délicates. Surtout la partie du coefficient de colline. Dans son article "Un modèle d'entraînement pour la synthèse d'enzymes chronométrées chez les bactéries" de 1966, dans la partie de l'équation différentielle de la concentration d'ARNmXi, il y a le termeZiet ce terme existe aussi dans d'autres livres qui parlent de cet oscillateur. Cependant, je ne sais pas ce que cela signifie. Goodwin n'a jamais mentionné ce que signifie ce terme. Je suppose qu'il s'agit du coefficient de colline, mais je ne comprends toujours pas très bien. Je vous partage le lien d'un chapitre de livre qui explique les équations de cet oscillateur (page 244) :

Oscillations biochimiques

Merci de votre aide.


Les ODE pour l'oscillateur Goodwin sont :

$$egin{align} frac{dX}{dt}=& k_1frac{K_i^n}{K_i^n+Z^n} -k_2X[1em] frac{dY}{dt} =& k_3X-k_4Y[1em] frac{dZ}{dt}=& k_5Y-k_6Zend{align}$$

Si vous supposez que $X$ est un ARNm et $Y$ une protéine, alors $Z$ peut être considéré comme une forme activée de la protéine (supposons par exemple une forme phosphorylée).

Le coefficient de Hill, $n$ grossièrement vous indique combien de monomères de la protéine activée se lient de manière coopérative au promoteur ou le nombre de monomères protéiques qui forment un complexe répresseur multimère qui inhibe la production de $X$. $K_i$ est une mesure de la force avec laquelle $X$ serait inhibé par $Z$. Pour être précis, il est égal à la concentration de $Z$ à laquelle la production de $X$ est la moitié de son taux maximum. (Similaire à la constante de Michaelis)

Ce que dit le modèle, c'est qu'à des valeurs plus élevées de $n$ (>8), il y a des oscillations soutenues (appelées cycles limites). A des valeurs inférieures, les oscillations amortissent. Notez que même pour de faibles valeurs de $n$, des oscillations soutenues (mais pas des types de cycles limités) peuvent survenir s'il y a un retard substantiel dans la boucle. Cependant ces oscillations ne sont pas aussi stables que les cycles limites aux perturbations.

Jetez un œil à ce post.

Ce sont quelques concepts avancés et vous pouvez commencer par lire ce livre de Steven Strogatz intitulé Non-linear Dynamics and Chaos*.


*Strogatz, Steven H. Dynamique non linéaire et chaos : avec des applications en physique, biologie, chimie et ingénierie. Presse Westview, 2014. (dernière édition) ; ISBN-13 : 978-0813349107 ; ISBN-10 : 0813349109


Biographie : Brian Goodwin

Brian Carey Goodwin (25 mars 1931 - 15 juillet 2009) était un mathématicien et biologiste canadien, professeur émérite à l'Open University et fondateur de la biologie théorique et des biomathématiques. Il a introduit l'utilisation de systèmes complexes et de modèles génératifs en biologie du développement. Il a suggéré qu'une vision réductionniste de la nature ne parvient pas à expliquer les caractéristiques complexes, proposant de manière controversée la théorie structuraliste selon laquelle les champs morphogénétiques pourraient remplacer la sélection naturelle dans la conduite de l'évolution. « Il était également un membre visible du mouvement de la troisième culture. ΐ]


Contenu

Les répressilateurs artificiels ont été conçus pour la première fois par Michael Elowitz et Stanislas Leibler en 2000, [2] complétant d'autres projets de recherche étudiant des systèmes simples de composants et de fonctions cellulaires. Afin de comprendre et de modéliser la conception et les mécanismes cellulaires qui confèrent la fonction d'une cellule, Elowitz et Leibler ont créé un réseau artificiel constitué d'une boucle avec trois répresseurs transcriptionnels. Ce réseau a été conçu à partir de zéro pour présenter une oscillation stable qui agit comme un système d'oscillateur électrique avec des périodes de temps fixes. Le réseau a été mis en place en Escherichia coli (E. coli) par transfert d'ADN recombinant. Il a ensuite été vérifié que les colonies modifiées présentaient effectivement le comportement oscillatoire souhaité.

Le répressilateur se compose de trois gènes connectés dans une boucle de rétroaction, de sorte que chaque gène réprime le gène suivant dans la boucle et est réprimé par le gène précédent. Dans l'insertion synthétique dans E. Coli, la protéine fluorescente verte (GFP) a été utilisée comme rapporteur afin que le comportement du réseau puisse être observé en utilisant la microscopie à fluorescence.

La conception du répressilateur a été guidée par des principes biologiques et de circuit avec des modèles d'analyse discrets et stochastiques. Six équations différentielles ont été utilisées pour modéliser la cinétique du système de répressilateur sur la base des concentrations de protéines et d'ARNm, ainsi que des paramètres appropriés et des valeurs de coefficient de Hill. Dans l'étude, Elowitz et Leibler ont généré des figures montrant des oscillations de protéines de répresseur, en utilisant l'intégration et des valeurs de paramètres typiques ainsi qu'une version stochastique du modèle de répressilateur utilisant des paramètres similaires. Ces modèles ont été analysés pour déterminer les valeurs de divers taux qui produiraient une oscillation soutenue. Il a été constaté que ces oscillations étaient favorisées par des promoteurs couplés à des sites de liaison de ribosomes efficaces, des répresseurs transcriptionnels coopératifs et des taux de dégradation de protéines et d'ARNm comparables.

Cette analyse a motivé deux caractéristiques de conception qui ont été intégrées aux gènes. Premièrement, les régions promotrices ont été remplacées par un promoteur hybride plus efficace qui combinait les E. coli promoteur du phage lambda PL (λ PL) avec répresseur lac (Lacl) et Têt répresseur (TetR) séquences d'opérateurs. Deuxièmement, pour réduire la disparité entre les durées de vie des protéines répresseurs et des ARNm, une étiquette carboxy terminale basée sur la séquence ssrA-ARN a été ajoutée à l'extrémité 3' de chaque gène répresseur. Cette étiquette est reconnue par les protéases qui ciblent la protéine pour la dégradation. La conception a été mise en œuvre à l'aide d'un plasmide à faible nombre de copies codant pour le répressilateur et d'un rapporteur à nombre de copies supérieur, qui ont été utilisés pour transformer une culture de E. coli.

Plantes Modifier

Les circuits circadiens des plantes comportent une boucle de rétroaction régulatrice transcriptionnelle appelée répressilateur. Dans la boucle de l'oscillateur principal (encadrée en gris) dans A. thaliana, la lumière est d'abord détectée par deux cryptochromes et cinq phytochromes. Deux facteurs de transcription, Circadian Clock Associated 1 (CCA1) et Late Elongated Hypocotyl (LHY), répriment les gènes associés à l'expression du soir comme Moment de l'expression CAB 1 (COT1) et activent les gènes associés à l'expression matinale en se liant à leurs promoteurs. COT1, un gène du soir, régule positivement ACC1 et LHY via un mécanisme inconnu. [3] Le facteur de transcription en phase du soir CCA1 Hiking Expedition (CHE) et l'histone déméthylase jumonji C domaine contenant 5 (JMJD5) répriment directement ACC1. D'autres composants se sont avérés être exprimés tout au long de la journée et inhibent ou activent directement ou indirectement un élément conséquent du circuit circadien, créant ainsi un réseau complexe, robuste et flexible de boucles de rétroaction. [3]

Expression de la phase du matin Modifier

La boucle d'expression de la phase matinale fait référence aux gènes et aux protéines qui régulent les rythmes au cours de la journée dans A. thaliana. Les deux gènes principaux sont LHY et CCA1, qui codent pour les facteurs de transcription LHY et CCA1. [4] Ces protéines forment des hétérodimères qui pénètrent dans le noyau et se lient au COT1 promoteur du gène, réprimant la production de la protéine TOC1. Lorsque la protéine TOC1 est exprimée, elle sert à réguler LHY et ACC1 par inhibition de leur transcription. Cela a ensuite été soutenu en 2012 par le Dr Alexandra Pokhilo, qui a utilisé des analyses informatiques pour montrer que le TOC1 jouait ce rôle d'inhibiteur de LHY et ACC1 expression. [5] La boucle du matin sert à inhiber l'allongement de l'hypocotyle, contrairement à la boucle de la phase du soir qui favorise l'allongement de l'hypocotyle. La boucle de la phase du matin s'est avérée incapable de supporter l'oscillation circadienne lorsque les gènes d'expression de la phase du soir ont été mutés, [5] suggérant l'interdépendance de chaque composant dans ce répressilateur naturel.

Expression de la phase du soir Modifier

Floraison précoce 3 (ELF3), Floraison précoce 4 (ELF4) et Phytohorloge1 (LUX) sont les éléments clés de l'expression des gènes de l'horloge en phase nocturne dans A. thaliana. Ils forment le complexe du soir, dans lequel LUX se lie aux promoteurs de Facteur d'interaction phytochrome 4 (PIF4) et Facteur d'interaction phytochrome 5 (PIF5) et les inhibe. [3] En conséquence, l'allongement de l'hypocotyle est réprimé en début de soirée. Lorsque l'inhibition est atténuée tard dans la nuit, l'hypocotyle s'allonge. La floraison photopériodique est contrôlée par le gène de sortie Gigantea (IG). IG est activé la nuit et active l'expression de Constant (CO), qui active l'expression de Locus fleuri T (FT). FT provoque alors la floraison en jours longs. [3]

Mammifères Modifier

Les mammifères ont développé un mécanisme de synchronisation endogène pour coordonner à la fois la physiologie et le comportement sur la période de 24 heures. [6] En 2016, les chercheurs ont identifié une séquence de trois inhibitions ultérieures au sein de ce mécanisme qu'ils ont identifié comme un répressilateur, qui est maintenant considéré comme un élément central majeur de ce réseau circadien. La nécessité de ce système a été établie par une série de knockouts de gènes parmi cryptochrome (Cri), période (Par), et Rev-erb -- gènes de base de l'horloge des mammifères dont les KO conduisent à l'arythmie. [6] Le modèle généré par ces chercheurs comprend Bmal1 en tant que moteur de la transcription médiatisée par E-box, Per2 et Cry1 comme répresseurs à boîte E précoce et tardive, respectivement, ainsi que le régulateur à boîte D Dbp et le récepteur nucléaire Rev-erb-α. Les inhibitions séquentielles par Rev-erb, Par et Cry1 peut générer des oscillations soutenues, et en fixant tous les autres composants, à l'exception de ce répressilateur, les oscillations ont persisté avec des amplitudes et des périodes similaires. [6] Tous les réseaux oscillants semblent impliquer n'importe quelle combinaison de ces trois gènes principaux, comme démontré dans divers schémas publiés par les chercheurs.

Le modèle de répressilateur a été utilisé pour modéliser et étudier d'autres voies et systèmes biologiques. Depuis, un travail approfondi sur les capacités de modélisation du répressilateur a été effectué. En 2003, la représentation et la validation par le répressilateur des modèles biologiques, étant un modèle avec de nombreuses variables, a été réalisée à l'aide du système Simpathica, qui a vérifié que le modèle oscille bien avec toutes ses complexités.

Comme indiqué dans le travail original d'Elowitz et Leibler, l'objectif ultime de la recherche sur les répressilateurs est de construire une horloge circadienne artificielle qui reflète son homologue naturel et endogène. Il s'agirait de développer une horloge artificielle à compensation de bruit et de température réduite afin de mieux comprendre les rythmes circadiens que l'on peut retrouver dans tous les domaines de la vie. [7] La ​​perturbation des rythmes circadiens peut entraîner une perte de rythmicité dans les processus métaboliques et transcriptionnels, et même accélérer l'apparition de certaines maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer. [8] En 2017, des oscillateurs générant des rythmes circadiens et peu influencés par la température ont été créés en laboratoire. [6]

Pathologiquement, le modèle de répressilateur peut être utilisé pour modéliser la croissance cellulaire et les anomalies qui peuvent survenir, telles que celles présentes dans les cellules cancéreuses. [9] Ce faisant, de nouveaux traitements peuvent être développés sur la base de l'activité circadienne des cellules cancéreuses. De plus, en 2016, une équipe de recherche a amélioré la conception précédente du répressilateur. Après l'analyse du bruit (traitement du signal), les auteurs ont déplacé la construction du rapporteur GFP sur le plasmide répressilateur et retiré les balises de dégradation ssrA de chaque protéine répresseur. Ceci allonge la période et améliore la régularité des oscillations du répressilateur. [dix]

En 2019, une étude a approfondi le modèle d'Elowitz et Leibler en améliorant le système de répressilateur en réalisant un modèle avec un état stable unique et une nouvelle fonction de taux. Cette expérience a élargi les connaissances actuelles sur la répression et la régulation des gènes. [11]

Biologie synthétique Modifier

Des répressilateurs artificiels ont été découverts en implantant une boucle d'inhibition synthétique dans E. coli. Cela représentait la première mise en œuvre d'oscillations synthétiques dans un organisme. D'autres implications de ceci incluent la possibilité de sauver des composants mutés d'oscillations de manière synthétique dans des organismes modèles. [7]

Le répressilateur artificiel est une étape importante de la biologie synthétique qui montre que les réseaux de régulation génétique peuvent être conçus et mis en œuvre pour exécuter de nouvelles fonctions. Cependant, il a été constaté que les oscillations des cellules déphasaient après un certain temps et que l'activité du répressilateur artificiel était influencée par la croissance cellulaire. L'expérience initiale [7] a donc donné une nouvelle appréciation à l'horloge circadienne trouvée dans de nombreux organismes, car les répressilateurs endogènes sont significativement plus robustes que les répressilateurs artificiels implantés. De nouvelles recherches au Centre de biologie quantitative RIKEN ont montré que des modifications chimiques d'une seule molécule de protéine pourraient former un oscillateur autonome et indépendant de la température . [12]

Les répressilateurs artificiels pourraient potentiellement aider la recherche et les traitements dans des domaines allant de la biologie circadienne à l'endocrinologie. Ils sont de plus en plus capables de démontrer la synchronisation inhérente aux systèmes biologiques naturels et les facteurs qui les affectent. [13]

Biologie circadienne Modifier

Une meilleure compréhension du répressilateur naturel dans les organismes modèles avec des synchronisations circadiennes endogènes, comme A. thaliana, a des applications dans l'agriculture, en particulier en ce qui concerne l'élevage et la gestion du bétail. [14]


Résultats

Nous décrivons maintenant la formulation mathématique de notre modèle idéalisé, ses principales caractéristiques et les spécificités liées au comportement induit par le bruit.

Formulation du modèle

Considérons un hypothétique système chimique clos soumis à un flux constant de matière (par exemple à travers une membrane semi-perméable) avec une température TF et la concentration du substrat CS. Pour un exothermique système, de la chaleur sera générée et dissipée dans l'environnement dont la température est Tex (Fig. 1A). L'état de cette non isotherme système est décrit par les concentrations de je composés (Cje) et sa température (T). Supposons maintenant que le système soit oscillatoire et que sa dynamique puisse être suffisamment bien décrite par un réseau élémentaire d'interactions limites montré sur la figure 1B (en faisant cela, nous supposons que les autres interactions sont très rapides et que les intermédiaires sont suffisamment abondants) : une boucle de rétroaction négative avec une entrée (supposée constante). Lorsqu'il n'y a pas de gradients internes de concentrations ou de température (par exemple, en raison de la petite taille du système et d'un mélange homogène rapide), le système peut être décrit en utilisant le formalisme d'un réacteur à réservoir agité en continu (CSTR) idéal 42 . Ensuite, les équations de ce système (nous utilisons une formulation sans dimension) sont

Dans les équations ci-dessus, la dynamique pour chaque variable (Cje et T) est régie par la somme d'un terme de génération non linéaire (gje) et un terme de décroissance linéaire (qui représente l'élimination continue de matière, Fig. 1A) τ et désignent le temps sans dimension et la constante de temps, respectivement. Par souci de généralité, nous avons inclus un terme supplémentaire dans le bilan thermique, pour tenir compte de la dissipation thermique (Fig. 1A). Une dépendance à la température d'Arrhenius des taux cinétiques (gje) est supposé et βje etje représentent respectivement l'énergie d'activation sans dimension et l'enthalpie de réaction. Nous supposons que la dissipation thermique suit la loi de refroidissement de Newton, avec un coefficient de transfert de chaleur effectif . Le réseau d'interactions (Fig. 1B) est composé d'un activateur (UNE), un médiateur (M) et un inhibiteur (je), avec une entrée constante S (gA0 = const dans l'équation (3)). Cette configuration garantit l'existence d'oscillations de cycle limite soutenues qui, selon le critère de Bendixon 20,26,43, ne peuvent exister avec seulement deux intermédiaires. Une exigence supplémentaire pour le comportement oscillatoire dans notre modèle est la non-linéarité des taux de réaction 20,26. À prendre comme une approximation asymptotique, nous représentons ces non-linéarités à travers une fonction échelon 44 , une idéalisation, qui est fréquemment utilisée dans les modèles mathématiques de régulation biochimique 45 . Ceci est réalisé dans notre modèle en utilisant la fonction step Heaviside H(x). Puisque dans les équations (3–5) H(x) est égal à 0 lorsque son argument est négatif et 1 sinon et, la production de UNE, M et je s'allume et s'éteint à leurs seuils correspondants θIA,MA etJE SUIS. Nous soulignons la ressemblance entre notre modèle sans dépendance à la température et le modèle d'oscillateur de Goodwin 25 .

Oscillateur chimique non isotherme minimal.

(A) Un hypothétique système chimique oscillatoire soumis à un flux constant de matière et de chaleur. La chaleur est dissipée vers l'environnement extérieur, qui est à température Tex (B) Un réseau d'interactions chimiques - une boucle de rétroaction négative avec une entrée (C) Série temporelle de concentrations de l'activateur (CUNE), médiateur (CM) et inhibiteur (Cje) (D) Série temporelle de température correspondante (T) (E) Le portrait du plan de phase montrant un cycle limite déterministe. Paramètres:je =T = 1,MA =JE SUIS =IA = 0,5,M =M = 0,UNE =je =UNE =je = 1, gUNE0 = 1,05, = 0,35, TF = 1, Tex = 0.95, Csi = 0, CUNE(0) = CM(0) = Cje(0) = 0, T(0) = 1.

Oscillations déterministes

Les résultats de simulation typiques sont illustrés à la figure 1C–E. Nous fixons les réactions de production de UNE et je être exothermiqueUNE > 0 etje > 0 dans l'équation (2)) et, pour simplifier, supposons que l'énergie d'activation et l'enthalpie de réaction de production de M sont négligeables, par rapport aux paramètres correspondants pour UNE et je (les valeurs de tous les paramètres sont répertoriées dans la légende de la figure). Nous sélectionnons exothermique réactions plutôt que endothermique, parce que les effets endothermiques devraient supprimer le système en réduisant sa température en raison de la consommation de chaleur dans les réactions chimiques, contrairement aux effets exothermiques conduisant à la génération de chaleur. Pour simplifier, nous supposons que la production à la fois de l'activateur et de l'inhibiteur est exothermique. Il convient de souligner à ce stade que les oscillateurs chimiques exothermiques ont été largement étudiés dans des systèmes catalytiques hétérogènes, par ex.CO et NH3 oxydation sur Pt et Pd 46,47,48 .

En l'absence de fluctuations, le système génère des oscillations périodiques à cycle limite soutenu des concentrations et de la température, indépendamment des conditions initiales et dans une large gamme de paramètres (comme cela a été confirmé par des simulations numériques). Notez que des oscillations de cycle limite sont également générées dans le isotherme version de notre modèle, c'est-à-dire T = const, en raison de la capacité inhérente de la boucle de rétroaction négative à générer des solutions périodiques 20 . En effet, l'accumulation de UNE met en marche la production de M, qui commence à s'accumuler et, éventuellement, active la production de je, qui supprime alors la production de UNE. Cependant, comme nous le démontrons dans la section suivante, les interactions mutuelles entre la dynamique chimique et thermique, c'est-à-dire non isotherme effets, sont nécessaires pour générer un cycle limite induit par le bruit en l'absence d'oscillations déterministes ( Fig. 3). La fréquence d'oscillation augmente avec Tex (Fig. 2A), ce qui est attendu, car plus T entraîne une accumulation plus rapide de UNE en raison de exothermique effets. Pour cette raison, nous avons sélectionné la température extérieure (Tex) comme paramètre de bifurcation et a identifié le point de bifurcation (Fig. 2B).

Oscillations de cycle limite soutenues induites par le bruit.

(A, B) Oscillations déterministes : effet de la température extérieure (Tex) sur la fréquence d'oscillation (A) et le point de bifurcation (B) sont indiqués (C–F) Oscillations induites par le bruit : aucune oscillation n'est observée pour une faible amplitude de bruit, σ = 0,02 (C), tandis que pour une grande amplitude de bruit (σ = 0,25 ) des oscillations sont induites (D, E) et un cycle limite est créé (F). Les autres paramètres sont comme dans la figure 1, à l'exception de Tex en A et B et Tex = 0,9 +w(τ) dans (C–F).

Le cycle limite induit par le bruit est dû à des effets non isothermes.

(A) Série temporelle du bruit appliqué (σ = 0,15) et de la température résultante et de la concentration d'inhibiteur avec une génération de chaleur constante (Qh = 0,5) – le système répond de manière aléatoire et aucun cycle limite n'est généré (B) (C) Série temporelle du bruit appliqué (σ = 0,15) et de la température résultante et de la concentration d'inhibiteur, le terme de génération de chaleur dépendant des concentrations (système non isotherme ) (D) cycle limite induit par le bruit correspondant. Les autres paramètres sont comme dans la figure 2.

Oscillations induites par le bruit

Afin d'étudier la réponse du système aux fluctuations de température, nous avons sélectionné Tex = 0,9, le point où aucun cycle limite déterministe n'existe (Fig. 2B) et le bruit appliqué au voisinage de cette valeur, en réglant Tex = 0,9 +w(τ), oùw(τ) est une gaussienne à moyenne nulle distribuée bruit blanc avec un écart type σ et une fréquence de modulation d'amplitude de 10 (dans toutes les simulations la valeur de ηw change toutes les 0,1 unité de temps sans dimension). Alors que les perturbations de faible amplitude n'ont aucun effet (Fig. 2C), l'augmentation de l'amplitude du bruit conduit à des oscillations de température et de concentrations (Fig. 2D, E). De manière intéressante et surprenante, le bruit avec une amplitude de = 0,25 récupère presque complètement le cycle limite déterministe obtenu à Tex = 0,95 (Fig. 2F, les autres paramètres sont identiques).

La capacité du système à générer le cycle limite induit par le bruit, qui est très similaire au cycle déterministe, peut donc être attribuée à la non isotherme effets, comme le montre la Fig. 3. Un exemple typique de la simulation numérique avec génération de chaleur constante (Qh = 0,5), qui a été ajustée de telle sorte que la valeur moyenne de la température soit égale à la valeur de base moyenne pour la température de la figure 2D (T 1,35), est illustré sur les figures 3A, B (notez que dans une telle formulation, la température ne dépend pas des concentrations, tandis que les vitesses de réaction dépendent toujours de la température). Comme prévu pour le système proche du point de bifurcation et sujet au bruit, il existe des excursions de concentration, mais elles sont aléatoires (Fig. 3A) et aucun cycle limite n'est généré (Fig. 3B). Avec la même amplitude de bruit et la même température de base moyenne, mais en incluant non isotherme effets dus à la dépendance de la génération de chaleur sur les taux de réaction, des oscillations de cycle limite induites par le bruit sont générées (Fig. 3C, D).

Un mécanisme pour expliquer ce phénomène pourrait être le suivant. Pour une génération de chaleur constante, l'équation (2) a un seul état stable stable (Fig. 4A, où Qg et Qr signifie respectivement génération et évacuation de chaleur). Pour un ensemble particulier de paramètres utilisés dans la Fig. 3 et aussi longtemps que Cje θIA (pas de répression de UNE), cette solution correspond à CUNE = gUNE0exp(−βUNE/T) = 0,5 (Fig. 4A), qui est le seuil pour M activation (les valeurs des paramètres sont répertoriées dans les légendes des figures). Fluctuations de l'évacuation de la chaleur causées par le bruit dans Tex (ces fluctuations sont délimitées comme indiqué par des lignes bleues en pointillés sur la figure 4A) induisent des fluctuations aléatoires dans le terme gUNE0exp(−βUNE/T) (taux de production de CUNE, équations (1,3)) autour de l'état stable stable. Cela ne peut conduire qu'à l'initiation et à l'arrêt aléatoires de la production de M et par conséquent, je (Fig. 3A). Dans le cas non isotherme, le terme de génération de chaleur est non linéaire et dépend de la production des deux UNE et je (équation (2)). Il en résulte deux solutions, selon que seul UNE, ou les deux UNE et je sont produites (Fig. 4B). L'état supérieur (T ≈ 1,85) est instable : lorsque les deux UNE et je sont produits, éventuellement je réprime inévitablement la production de UNE, conduisant à une transition vers l'état inférieur (T § 1.32). Cet état est stable à faible bruit (Fig. 2C), mais instable à de grandes perturbations qui peuvent induire une rétroaction positive sur la génération de chaleur due à l'exothermicité (équations (1,2)), conduisant à la production des deux UNE et je de nouveau. Par conséquent, des transitions rapides entre les états peuvent se produire (Fig. 4B), générant un cycle limite qui ressemble au cycle limite déterministe. Notez que les valeurs de la température pour deux solutions (Fig. 4B) correspondent aux températures de base et de pic de la Fig. 3C.

Mécanisme de génération de cycle limite induit par le bruit.

Solution à l'état d'équilibre de l'équilibre de température (équation (2)) avec (A) source de chaleur constante (Qg = 0,5) et (B) avec la fonction de génération de chaleur dépendant des termes cinétiques (Qg =UNEgUNE0exp(−βUNE/T) +jeexp(−βje/T)). La fonction d'évacuation de la chaleur est Qr = (TTF) + ϕ(TTex) dans les deux cas. Les lignes bleues en pointillés correspondent à la plage de Qr fluctuations pour = 0,15 gUNE0exp(−βUNE/T) correspond au terme de production de UNE (lorsque la concentration de je est inférieur au seuil de répression). Les autres paramètres sont comme dans la figure 3.

Ce mécanisme de génération de cycle limite induit par le bruit devrait s'appliquer aux oscillateurs à boucle de rétroaction négative exothermique en général. La seule exigence pour les vitesses de réaction est l'existence d'une transition nette entre pratiquement aucune production et une production à une vitesse presque maximale. Une exigence supplémentaire est que cette transition doit entraîner un changement significatif du taux de production de chaleur. Dans un tel système, après la transition de l'état inférieur à la courbe supérieure de génération de chaleur (comme le montre la flèche pointant vers le haut sur la figure 4B), le taux de génération de chaleur est supérieur au taux d'évacuation de la chaleur. En conséquence, la température augmentera et le système tendra vers l'état supérieur. La transition de l'état supérieur à la courbe inférieure de génération de chaleur (comme indiqué par la flèche pointant vers le bas sur la figure 4B) entraîne le taux de génération de chaleur, qui est inférieur au taux d'élimination de la chaleur. Dans ce cas, en raison de la baisse de température, le système tendra vers l'état inférieur. Des exemples d'oscillations de cycle limite soutenu induites par le bruit obtenues dans notre modèle avec la fonction Heaviside dans les taux de réaction remplacés par une dépendance plus réaliste de la fonction Hill sont présentés dans Information supplémentaire (voir les figures supplémentaires S1–S4 en ligne). Étant donné que des oscillations se produisent dans la version isotherme de notre modèle (voir la section Oscillations déterministes), la version endothermique devrait également générer des orbites périodiques déterministes (voir la Fig. S5 supplémentaire en ligne). Cependant, en raison de l'absence de l'effet d'accélération de la réaction exothermique, la réponse du système endothermique au bruit est irrégulière (voir les figures supplémentaires S5 et S6 en ligne).

Fréquence caractéristique des oscillations induites par le bruit et effet du bruit coloré

Les oscillations induites par le bruit obtenues ont une distribution de fréquence relativement étroite avec une certaine fréquence caractéristique, comme le montre la figure 5A–C. Un exemple typique de simulation numérique, réalisée avec Tex = 0,9 +w(τ) pour 1000 unités de temps sans dimension, est représenté sur la figure 5B. La série temporelle correspondante d'entrée stochastique (Tex) sont représentés sur la figure 5A (notez la fréquence élevée de variation d'amplitude : w change toutes les 0,1 unité de temps sans dimension). La distribution de fréquence (figure 5C) est calculée comme l'inverse de la distribution des intervalles entre pointes calculée à partir de la figure 5B. Une certaine fréquence caractéristique peut être reconnue sur la figure 5C.

Distribution de fréquence induite par le bruit.

(A–C) Distribution de fréquence des oscillations induites par le bruit blanc, montrant la série chronologique du bruit appliqué (Tex = 0,9 +w(τ)) avec la distribution de séquence aléatoire correspondante (A), les oscillations induites (B) et la distribution de fréquence correspondante (C) (D–F) Distribution de fréquence des oscillations induites par le bruit coloré (Tex = 0,9 +c(τ)), montrant la série temporelle du bruit corrélé appliqué (l'exposant de corrélation est oui = 0,5) avec la distribution de séquence aléatoire correspondante (D), les oscillations induites (E) et la distribution de fréquence correspondante (F). L'amplitude du bruit est = 0,15 dans les deux cas, les autres paramètres sont comme sur la figure 1.

La forme de la distribution de fréquence et l'emplacement de la fréquence caractéristique changent de manière significative lorsqu'un bruit coloré (corrélé) est appliqué à la place du bruit blanc. Un exemple typique est montré sur la figure 5D-F (notez que dans les deux cas, les séquences aléatoires sont distribuées gaussiennes avec le même écart type). Nous utilisons la même procédure pour les simulations numériques que pour le bruit blanc, c'est-à-dire en utilisant Tex = 0,9 +c(τ), sauf que maintenant ηc(τ) est la loi de puissance moyenne nulle bruit corrélé, qui est, en plus de l'écart type de la distribution gaussienne σ, caractérisé par un exposant de corrélation γ :

Pour générer des séquences corrélées, nous avons utilisé un algorithme basé sur la méthode de filtrage de Fourier modifiée 49 (voir la section Méthodes pour plus de détails). Pour le bruit coloré, la distribution de fréquence est asymétrique à gauche et il y a un décalage très important de la fréquence caractéristique vers des valeurs plus élevées. Notez que la figure 5 montre des exemples typiques de 20 simulations répétées pour chaque type de bruit (chacune pour 1000 unités de temps) et la tendance caractéristique de la distribution asymétrique à gauche avec une fréquence caractéristique plus élevée pour le bruit coloré a été obtenue dans tous les cas. Il est important de noter que ces différences substantielles dans la réponse du système au bruit blanc et corrélé ne sont pas une conséquence des taux de réaction idéalisés et plutôt artificiels que nous avons utilisés dans notre formulation (fonction Heaviside), car des différences similaires sont observées avec des taux de réaction plus réalistes (voir Fig. S4 en ligne). Ces différences peuvent donc être attribuées à la corrélation du bruit (nous discutons de ce point dans la section suivante).

Les figures 6A et 6B montrent les résultats moyennés de simulations répétées pour différentes amplitudes de bruit (les barres d'erreur montrent l'écart type entre les mesures). Des simulations numériques (chaque exécution correspond à 1000 unités de temps sans dimension, comme sur les figures 5B, E) ont été effectuées jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de changement significatif (plus de 10 %) dans l'erreur d'écart type cumulée entre les mesures, bien qu'au moins 10 exécutions ont été effectuées pour chaque type de bruit et chaque valeur de l'amplitude du bruit. Nous avons calculé la fréquence caractéristique comme la médiane de la distribution de fréquence (comme illustré sur la figure 5C, F), notée Fm dans la Fig. 6A, B, où l'écart absolu médian (FOU) est également affiché. On peut voir que la distribution de fréquence est relativement étroite, tandis que la FOU l'amplitude est légèrement plus élevée pour le bruit coloré. De plus, la fréquence caractéristique augmente avec l'augmentation de l'amplitude du bruit et atteint une valeur relativement constante pour les amplitudes de bruit intermédiaires. Nous avons vérifié qu'il n'y a pas d'optimum dans le Fm en fonction de σ, même pour de très grandes amplitudes de bruit (jusqu'à σ = 1), pour une plage de l'exposant de corrélation de 0,1 γ ≤ 2,5. Nous restreignons cependant notre représentation pour σ ≤ 0.3 puisque pour σ > 0.3, la température (Tex) atteint des valeurs négatives. Chose intéressante, la fréquence caractéristique était significativement plus élevée pour le bruit coloré (comparer les Fig. 6A et B).

Dépendance en fréquence et résonance de cohérence.

(A, B) La dépendance de la fréquence caractéristique des oscillations induites par le bruit (calculée comme la médiane de la distribution de fréquence) sur l'amplitude du bruit pour le bruit blanc (A) et le bruit coloré (B) les barres d'erreur montrent l'écart type entre les mesures et MAD est l'écart absolu médian (C) Les tracés de la fréquence caractéristique par rapport à l'exposant de corrélation pour deux amplitudes de bruit différentes, les barres d'erreur montrent l'écart type entre les mesures. Les paramètres sont comme dans la figure 1, à l'exception de Tex = 0,9 +w(τ) et Tex = 0,9 +c(τ) pour le bruit blanc et coloré, respectivement.

Résonance de cohérence

Un tracé de la fréquence caractéristique en fonction de l'exposant de corrélation (γ) a montré un maximum prononcé pour différentes valeurs d'amplitude de bruit. Des exemples typiques sont montrés sur la figure 6C (les barres d'erreur montrent l'écart type entre les mesures). Cela indique l'existence d'une résonance stochastique, se produisant en l'absence de tout forçage périodique. Par conséquent, un tel phénomène peut être classé comme une résonance stochastique autonome, également connue dans la littérature sous le nom de cohérence résonance 17,50 . Notez que (sans surprise) pour des valeurs élevées de l'exposant de corrélation (bruit faiblement corrélé) l'amplitude de fréquence caractéristique tend vers celle induite par le bruit blanc (non corrélé) (comparer les figures 6C et 6A). L'apparition d'une résonance de cohérence en fonction de l'exposant de corrélation peut être attribuée à des dissemblances dans les densités spectrales de bruit avec une corrélation différente. Pour le bruit blanc (et pour les grandes valeurs de ), la densité spectrale est également répartie sur le spectre de fréquences. En revanche et en fonction de sa corrélation, le bruit coloré a une densité spectrale améliorée pour certaines gammes de fréquences (voir les figures supplémentaires S7 et S8 en ligne). Le chevauchement entre ces fréquences améliorées et la fréquence naturelle de l'oscillateur peut entraîner un optimum dans le tracé de la fréquence caractéristique induite par le bruit en fonction de l'exposant de corrélation.

Dans sa formulation classique, la résonance stochastique est reconnue dans un système dynamique soumis à la fois à un faible forçage périodique et à une perturbation aléatoire, comme l'émergence d'un comportement périodique, qui est absent lorsque le forçage ou la perturbation sont absents 9 . De tels systèmes sont généralement bistable, la probabilité d'occupation d'un certain état stable étant affectée par le bruit, alors qu'un certain bruit « optimal » peut conduire à une commutation quasi-périodique entre ces deux états. Dans le modèle présenté ici, nous avons trouvé que des oscillations de cycle limite soutenues sont créées par des fluctuations stochastiques de température en l'absence de tout forçage périodique dans le système oscillatoire qui n'a pas de multiples états stables. Ces oscillations induites par le bruit sont dues à la présence de boucle de rétroaction négative en termes cinétiques (équations (3–5) et Fig. 1B) et l'interaction mutuelle entre la dynamique chimique et thermique. C'est-à-dire qu'ils sont dus à effets non isothermes, tandis que cohérence résonance est observé en fonction de l'amplitude du bruit coloré corrélé fluctuations de température.


Résultats

Modélisation mathématique de l'horloge circadienne des mammifères

Nous développons un nouveau modèle mathématique de l'horloge circadienne intracellulaire des mammifères. Ce modèle contient des gènes, des ARNm et des protéines clés (PER1, PER2, CRY1, CRY2, BMAL1/2, NPAS2, CLOCK, CKIε/δ, GSK3β, Rev-erbα/β) qui se sont avérés essentiels à la chronologie circadienne des mammifères ( Figure 1A). Bien que considérablement développé, le modèle est largement basé sur notre modèle précédent, qui a fait des prédictions surprenantes sur le chronométrage des mammifères qui ont ensuite été vérifiées expérimentalement ( Forger et Peskin, 2003 Gallego et al, 2006 Ko et al, 2010 Yamada et Forger, 2010 ). Les modifications et extensions du modèle sont décrites dans les Matériaux et méthodes, Informations supplémentaires et Tableaux supplémentaires 1 et 2. Les paramètres du modèle sont estimés à l'aide de données expérimentales et d'une méthode de recuit simulé (un chercheur de paramètres stochastiques global) ( Gonzalez et al, 2007 ) (voir Matériels et méthodes, Informations supplémentaires et Tableau supplémentaire 3 pour plus de détails). En particulier, nous avons incorporé des constantes de vitesse déterminées expérimentalement (tableau supplémentaire 3) ( Kwon et al, 2006 Siepka et al, 2007 Chen et al, 2009 Suter et al, 2011), correspondent aux évolutions temporelles de l'ARNm et des protéines (Figure 2A et B) ( Lee et al, 2001 Reppert et Weaver, 2001 Ueda et al, 2005 ) et correspondent à l'abondance relative des protéines (Figure 2C) ( Lee et al, 2001 ).

Notre modèle prédit avec précision le phénotype des mutations connues des gènes de l'horloge circadienne centrale (noyaux suprachiasmatiques, SCN) ( Yoo et al, 2005 Baggs et al, 2009 Ko et al, 2010 ), que les autres modèles ne prédisent pas (Tableau I) ( Forger et Peskin, 2003 Leloup et Goldbeter, 2003 Mirsky et al, 2009 Relógio et al, 2011 ). Fait intéressant, notre modèle montre des phénotypes opposés pour Cry1 −/− et Cry2 −/− appariement des données expérimentales ( Liu et al, 2007 ). Il existe deux différences entre CRY1 et CRY2 dans notre modèle. D'abord, Cry1 la transcription est retardée par la répression par Rev-erbα et Rev-erbβ ( Preitner et al, 2002 Liu et al, 2008 Ukai-Tadenuma et al, 2011 ). En outre, Cry1 L'ARNm est plus stable que Cry2 L'ARNm et la protéine CRY1 sont plus stables que la protéine CRY2 ( Busino et al, 2007 Siepka et al, 2007 Chen et al, 2009 ). Étant donné qu'une demi-vie plus longue entraîne un retard des rythmes et que les rythmes retardés entraînent une période plus longue ( Forger, 2011 Ukai-Tadenuma et al, 2011 ), la suppression de CRY1 raccourcit la période et la suppression de CRY2 allonge la période. Les phénotypes opposés de L'horloge −/− (mutation nulle) et L'horloge Δ19/+ (mutation dominante négative) sont également correctement simulés dans le modèle pour la première fois ( Vitaterna et al, 1994 Herzog et al, 1998 Debruyne et al, 2006 ). De plus, notre modèle prédit également les phénotypes mutants des neurones isolés du SCN, qui sont différents des tranches du SCN (Liu et al, 2007 ). Nous notons que les tranches de SCN ont une expression génique significativement plus élevée de par1 et par2 via la voie CREB/CRE que les neurones isolés du SCN ( Yamaguchi et al, 2003 ). Fait intéressant, lorsque nous avons réduit par1 et par2 expression d'environ 60% dans notre modèle, notre modèle était capable de reproduire avec précision les phénotypes de neurones SCN isolés (tableau II).

Gène RCS Animal Nouveau modèle Relógio et al (2011) Mirsky et al (2009) Leloup et Goldbeter (2003) Le faussaire et Peskin (2003)
Cry1 −/− Court Court −1 Longue RA Court PO
Cry2 −/− Longue Longue +1.6 Longue Longue Court Longue
Per1 −/− PO RA RA Court Longue
Per1 ldc PO Court/AR
Per2 −/− RA RA RA Court Court
Per2 ldc Court/AR
Bmal1 −/− RS** RA RA RA RA RA
Bmal1 −/+ PO* +0.1 RA N / A RA Longue
L'horloge −/− PO Court −0.2 Longue RA RA RA
L'horloge 19/Δ19 RA* Longue RA Longue N / A N / A N / A
L'horloge 19/+ Longue* +1.1 Longue N / A N / A N / A
Npas2 −/− PO Court PO N / A N / A N / A N / A
Rev-erb−/− Court −0.2 RA Court N / A PO
CK1tau/tau Court Court −3 N / A N / A Court Court
  • Ici, nous indiquons si le phénotype prédit par notre modèle, ou vu dans les données expérimentales est WT, rythmique stochastique (SR), arythmique (AR) ou montre un changement de période en heures. Les données expérimentales peuvent être trouvées dans Baggs et al (2009) ainsi que les références qui y sont citées, à l'exception de celles marquées d'un * qui se trouvent dans Yoo et al (2005) et ** que l'on peut trouver dans Ko et al (2010). Voir Matériaux et méthodes pour plus de détails. Le gras représente la prédiction de phénotype différente des modèles précédents par rapport au nouveau modèle. NA représente non disponible. Pour le modèle Leloup-Goldbeter, le premier jeu de paramètres du modèle est utilisé.
Gène dSCN Modèle
Cry1 −/− RA RA
Cry2 −/− Longue +2.3
Per1 −/− RA
Per1 ldc RA
Bmal1 −/− RA* RA
  • Ici, nous indiquons si le phénotype prédit par notre modèle, ou vu dans les données expérimentales est arythmique (AR) ou montre un changement de période en heures. Les données expérimentales peuvent être trouvées dans Liu et al (2007) , à l'exception de ceux marqués d'un * que l'on retrouve dans Ko et al (2010). Voir Matériaux et méthodes pour plus de détails.

Nous avons également effectué une analyse de sensibilité pour examiner quels paramètres déterminent la période de notre modèle. Quatre des cinq paramètres les plus élevés, dans notre analyse de sensibilité, figuraient également parmi les cinq premiers trouvés dans une analyse de sensibilité précédente avec le modèle original de Forger et Peskin et qui a été utilisé pour conclure que PER2 joue un rôle dominant dans la détermination de la période ( Wilkins et al, 2007 ) (voir la figure supplémentaire 1).

Un bon équilibre stoechiométrique entre les activateurs et les répresseurs est crucial pour des rythmes soutenus

Étant donné que notre modèle mathématique peut prédire avec précision le phénotype des mutations connues de l'horloge circadienne des mammifères, nous avons ensuite cherché un mécanisme qui pourrait expliquer pourquoi certains phénotypes étaient rythmiques, tandis que d'autres ne l'étaient pas. Nous avons découvert que la stœchiométrie joue un rôle clé dans la détermination des mutations présentant des phénotypes rythmiques. Ici, nous définissons la stoechiométrie comme le rapport moyen entre la concentration de répresseurs (toutes les formes de PER et de CRY dans le noyau) à celle d'activateurs (toutes les formes de BMAL-CLOCK/NPAS2 dans le noyau) sur une période. De plus, nous nous référons spécifiquement aux répresseurs et aux activateurs des boîtes E/E' lorsque nous discutons de la stoechiométrie. Nous avons constaté que les mutations qui rendaient la stoechiométrie trop élevée ou trop faible, produisaient des phénotypes arythmiques (figure 3A). Tant que les mutations permettaient à la stoechiométrie d'être autour d'un rapport de 1 à 1, des oscillations d'amplitude relativement élevée ont été observées. Ainsi, nous prédisons que la stœchiométrie fournit un principe unificateur pour déterminer la rythmicité des mutations de l'horloge circadienne des mammifères. Pour tester davantage ce principe, nous avons exprimé de manière constitutive soit le gène Per2 (le gène répresseur dominant) soit les gènes Bmal et Clock (les gènes activateurs dominants) à différents niveaux. Fait intéressant, dans une plage centrée près d'une stoechiométrie 1-1, le modèle montre des oscillations soutenues avec une amplitude élevée (Figure 3B). Cependant, si la stoechiométrie était trop élevée ou trop faible, les rythmes sont amortis ou complètement absents (figure 3B). Cela correspond à une étude expérimentale récente montrant que l'amplitude et la durabilité des rythmes de population augmentent lorsque le niveau de PER-CRY est augmenté plus près de celui de BMAL1-CLOCK dans les fibroblastes de souris ( Lee et al, 2011 ).

Nous avons défini la stoechiométrie comme le rapport moyen entre les concentrations totales de répresseurs et celles d'activateurs sur une période. Cependant, des travaux récents ont montré que CRY1 a une activité répresseur plus forte que CRY2. Les mécanismes biochimiques sous-jacents à ce résultat n'ont pas été entièrement identifiés ( Khan et al, 2012 ). Si la différence est due à un mécanisme post-traductionnel différent (par exemple, la liaison entre PER et CRY, qui pourrait affecter la concentration de répresseur dans le noyau), la définition actuelle de la stoechiométrie peut être conservée. Sinon, une définition plus sophistiquée de la stoechiométrie peut être nécessaire (par exemple, une définition qui donne plus de poids à la concentration de CRY1 qu'à celle de CRY2).

Comment la stœchiométrie génère des rythmes

Pour tester le rôle de la stoechiométrie dans le maintien des oscillations, nous avons développé un modèle simple en modifiant le modèle Goodwin bien étudié ( Goodwin, 1965 ) pour inclure un activateur (UNE), qui devient inactif lorsqu'il est lié par un répresseur (P) (Figure 3C). La transcription est proportionnelle à la fraction d'activateur libre qui n'est pas liée par le répresseur, F(P, UNE, K) ( Buchler et Cross, 2009 ), correspondant aux données expérimentales de l'horloge circadienne des mammifères (Figure supplémentaire 2) ( Froy et al, 2002 ). ARNm (M) est traduit en une protéine répresseur (Pc). La protéine pénètre dans le noyau (P) et lie et inhibe l'activateur (UNE). Cela génère une boucle de rétroaction négative unique (SNF) puisque l'activateur est exprimé de manière constitutive. Le modèle est similaire à un modèle mathématique précédemment publié ( François et Hakim, 2005 ) cependant, nous permettons à la fois l'association et la dissociation de l'activateur et du répresseur (par un K), qui s'avère cruciale pour comprendre les effets de la stoechiométrie. En ne dimensionnant pas et en fixant les taux de clairance de toutes les espèces à égalité (pour augmenter les chances d'oscillations, voir Forger, 2011 ), il ne reste que deux paramètres : la concentration en activateur (UNE) et la constante de dissociation (K) (voir Informations complémentaires).

Quand on a changé la concentration en activateur, ce qui a changé la stoechiométrie (rapport moyen entre le niveau de répresseur (P) au niveau d'activateur (UNE)), des oscillations soutenues n'ont été observées qu'à une stoechiométrie d'environ 1-1 similaire à notre modèle détaillé (Figure 3D). Comme l'autre paramètre (K) a diminué (indiquant une liaison serrée), la plage de stoechiométrie qui a permis l'oscillation a augmenté (figure 3D). Fait intéressant, si la liaison était trop faible, les rythmes ne se produisaient pas. La liaison étroite entre les activateurs et les répresseurs se retrouve également dans le modèle détaillé et dans l'horloge circadienne des mammifères ( Lee et al, 2001 Froy et al, 2002 Sato et al, 2006 ). Cela indique que les rythmes soutenus nécessitent une liaison étroite ainsi qu'une stœchiométrie équilibrée dans l'horloge circadienne.

De nombreuses études antérieures ont soutenu que les réponses ultrasensibles (par exemple, un grand changement dans le taux de transcription pour un petit changement dans la concentration du répresseur ou de l'activateur) peuvent provoquer des oscillations dans les boucles de rétroaction (Kim et Ferrell, 2007 Buchler et Louis, 2008 Novak et Tyson, 2008 Forger , 2011 ). Une étude précédente a montré qu'une réponse ultrasensible peut être générée par une liaison étroite d'activateurs et de répresseurs dans un système synthétique ( Buchler et Cross, 2009 ). Pris ensemble, cela fournit un mécanisme potentiel de génération de rythme. C'est-à-dire que lorsque la concentration totale du répresseur est supérieure à celle des activateurs, le répresseur séquestre et tamponne l'activateur et inhibe complètement la transcription (Buchler et Louis, 2008). Au fur et à mesure que le répresseur est épuisé, les activateurs libres en excès ne sont plus séquestrés par les répresseurs et sont libres d'activer la transcription. A ce seuil, la transcription du répresseur montre une réponse ultrasensible à la concentration du répresseur ou de l'activateur. Les réponses ultrasensibles amplifient les rythmes et empêchent les rythmes de s'atténuer ( Forger, 2011 ). Dans notre modèle simple et détaillé, nous avons trouvé des réponses ultrasensibles autour d'une stoechiométrie 1-1 (Figure supplémentaire 3A). Lorsque la stoechiométrie n'était pas d'environ 1-1, aucune réponse ultrasensible n'a été observée et les deux modèles n'ont pas montré de rythme soutenu.

Au cours d'une journée, à mesure que les niveaux de répresseur et d'activateur changent, la stoechiométrie et la sensibilité changent également. Nous avons constaté que la stoechiométrie moyenne 1-1 est nécessaire pour générer la réponse ultrasensible, ce qui provoque des rythmes par analyse mathématique, confirmant nos résultats de simulation (Figure 3D). C'est-à-dire que, via une analyse de stabilité locale et globale, nous avons dérivé une plage approximative des stoechiométries (〈S〉) qui permettent des oscillations

(voir Informations complémentaires). En accord avec nos simulations illustrées à la figure 3D, cette analyse mathématique suggère également que (1) des oscillations sont observées autour d'une stoechiométrie 1-1 (2) la stoechiométrie doit être >8/9 pour une rythmicité soutenue (3) comme liaison entre les activateurs et les répresseurs se resserrent, la borne supérieure de la stoechiométrie augmente (4) si la liaison est trop faible (par exemple, K=10 −3 ), les oscillations soutenues ne se produisent pas.

Une boucle de rétroaction négative supplémentaire améliore la régulation de l'équilibre stoechiométrique

Si la stoechiométrie est la clé d'une oscillation soutenue, existe-t-il des mécanismes dans les horloges circadiennes qui maintiennent l'équilibre de la stoechiométrie des composants ? La boucle de rétroaction négative supplémentaire de la structure de boucle de rétroaction négative-négative (NNF), trouvée dans les horloges circadiennes, aide-t-elle à équilibrer la stoechiométrie ? Pour tester cette structure, nous avons ajouté une boucle de rétroaction négative supplémentaire dans notre modèle simple (figure 4A). Auparavant, d'autres études suggéraient qu'une boucle de rétroaction positive, plutôt que négative, pourrait soutenir les horloges intracellulaires ( Barkai et Leibler, 2000 Stricker et al, 2008 Tsaï et al, 2008 et al, 2009 ). Nous avons testé ces structures en incluant une protéine supplémentaire R (Rev-ERBs ou RORs dans les horloges circadiennes des mammifères) qui est transcrit d'une manière similaire à P. R puis réprime (comme dans les Rev-erbs) ou favorise (comme dans les Rors) la production de A dans la boucle de rétroaction négative-négative (NNF) ou la structure de boucle de rétroaction positive-négative (PNF), respectivement (Figure 4A).

Nous avons étudié comment les structures SNF, NNF et PNF maintiennent efficacement l'équilibre stoechiométrique lorsque les paramètres du modèle (par exemple, le taux de transcription) sont modifiés. Avec à la fois la simulation et l'analyse en régime permanent, nous avons constaté que la structure NNF est la meilleure pour maintenir la stoechiométrie équilibrée tandis que la structure PNF est la pire pour maintenir la stoechiométrie équilibrée, quels que soient les paramètres perturbés (voir Informations supplémentaires, Figure 4B et Figure supplémentaire 4A-C ). De plus, notre modèle détaillé, qui suit également la structure NNF, a également soigneusement équilibré la stoechiométrie en contrôlant l'expression des répresseurs et des activateurs. Renversement du répresseur Cry1 conduit à une expression plus élevée des répresseurs, qui sont contrôlés par les boîtes E, et à une expression plus faible des activateurs, qui sont contrôlés par un RORE (figure 4C). Des effets opposés sont observés lorsque l'activateur CLOCK est retiré (figure 4C). Ce contrôle actif des répresseurs et/ou activateurs via la structure NNF régule étroitement l'équilibre stoechiométrique (Figure supplémentaire 4D) et correspond aux données expérimentales sur le dosage des gènes ( Baggs et al, 2009 ). De plus, le modèle détaillé (avec la structure NNF) prédit également correctement le changement d'expression des gènes d'horloge après la suppression de la boucle de rétroaction négative supplémentaire (Rev-erb−/− ) (Figure 4D) ( Liu et al, 2008 Bugge et al, 2012 Cho et al, 2012 ). En particulier, le knock-out du Rev-erbα,β diminue l'expression de PER, mais augmente l'expression de CRY1. Pour notre ensemble nominal de paramètres, des oscillations sont toujours possibles lorsque cette rétroaction négative supplémentaire est supprimée. Cependant, pour d'autres ensembles de paramètres, où la stoechiométrie n'est pas aussi bien équilibrée, la suppression de cette rétroaction négative supplémentaire arrête la rythmicité (voir ci-dessous). Cela pourrait expliquer le phénotype de la Rev-erb−/− , qui montrent quelques indices de rythmicité ( Bugge et al, 2012 Cho et al, 2012 ). Notre modèle prédit que la génération de rythme reste dans les types cellulaires qui ont une stoechiométrie presque équilibrée, et un manque de rythmes dans les types cellulaires sans stoechiométrie équilibrée.

Une boucle de rétroaction négative supplémentaire lente améliore la robustesse des rythmes

Notre hypothèse centrale est que, comme la stoechiométrie est plus étroitement régulée, des oscillations se produiront sur une plus large gamme de paramètres. Pour confirmer cela, nous avons fait varier le taux de transcription de l'activateur (ou la concentration d'activateur dans le SNF) et le taux de transcription du répresseur pour déterminer quels ensembles de paramètres ont produit des oscillations. Alors que les structures SNF, NNF et PNF ont presque le même comportement avec leurs paramètres nominaux (stœchiométrie moyenne, amplitude et période, voir Figure supplémentaire 5A), la structure NNF a oscillé sur la plus large plage de paramètres et la PNF a oscillé sur la plage la plus étroite de paramètres dans le modèle simple (Figure 5A Figure supplémentaire 5C). Fait intéressant, à mesure que l'activateur devient plus stable (c'est-à-dire que la rétroaction négative supplémentaire devient plus lente), la structure NNF permet des oscillations soutenues sur une plus large gamme de paramètres (figure supplémentaire 5D). En effet, le taux de clairance des activateurs est significativement plus lent que les autres composants de l'horloge circadienne (Tableau supplémentaire 4) ( Kwon et al, 2006 ).

Nous avons également vérifié le rôle de la structure NNF dans notre modèle d'horloge mammifère détaillé. Nous avons modifié la structure NNF du modèle détaillé à celle d'un SNF en fixant la concentration de l'activateur (BMAL, CLOCK et NPAS2) à la valeur moyenne trouvée dans leurs simulations WT. Nous avons également construit la structure PNF en convertissant le répresseur (REV-ERB) en un activateur (par exemple, les ROR) dans la structure NNF. Cela n'a pas modifié de manière significative les rythmes dans la boucle de rétroaction principale (figure supplémentaire 5B), ce qui correspond à des études précédentes qui ont montré que la perte ou le changement de rythme dans les activateurs avait peu d'effet sur les rythmes circadiens (Liu et al, 2008 ). Il est tentant de conclure que les boucles de rétroaction supplémentaires contrôlant les activateurs ne sont pas importantes dans les horloges circadiennes. Cependant, lorsque nous avons changé le taux de transcription du répresseur (Par) et activateur (Bmal, L'horloge et Npas2), le modèle d'origine (avec une structure NNF) avait la plus large gamme de paramètres où des oscillations se produisent tandis que la structure PNF avait la gamme de paramètres la plus étroite (Figure 5B). Fait intéressant, des expériences ont montré que les REV-ERB jouent un rôle plus dominant que les ROR, indiquant que notre mécanisme proposé peut jouer un rôle important dans in vivo chronométrage ( Liu et al, 2008 ). Ainsi, le choix de la rétroaction supplémentaire a grandement affecté la plage de paramètres où les oscillations sont observées.

Nous avons également examiné le rôle de la boucle de rétroaction négative supplémentaire dans un modèle mathématique de la Drosophile horloge circadienne ( Smolen et al, 2002 ). L'étude originale qui a développé le modèle a conclu que les structures NNF et SNF étaient également susceptibles de présenter des oscillations. Cependant, leur étude n'a modifié les taux de transcription que de 20 %. Avec une plus grande perturbation des paramètres, nous avons constaté que la boucle de rétroaction négative supplémentaire étend considérablement la gamme de paramètres qui produisent des oscillations (figure 5C).

Une conception de réseau pour le chronométrage cellulaire où le maintien d'une période fixe est crucial

La structure PNF peut créer un oscillateur biologique robuste qui a une période réglable lorsque la boucle de rétroaction positive supplémentaire est rapide (c'est-à-dire que l'activateur se dégrade rapidement) ( Stricker et al, 2008 Tsaï et al, 2008 et al, 2009 ) (Figure 6A). Conformément à ces résultats, notre modèle simple avec la structure PNF a une période réglable pour les changements dans les niveaux d'expression génique (figure 6C). Cependant, le modèle simple avec la structure NNF a une période presque constante en présence de grands changements dans les niveaux d'expression génique (Figure 6B et D). De plus, cette structure NNF devient plus robuste à mesure que la boucle de rétroaction négative supplémentaire ralentit (c. et al, 2008 Tsaï et al, 2008 et al, 2009 ). Par conséquent, nos résultats proposent deux conceptions différentes d'oscillateurs biologiques robustes. La structure NNF (figure 6B) convient aux horloges biologiques dans lesquelles le maintien d'une période fixe est crucial (par exemple, les horloges circadiennes). La structure PNF (figure 6A) convient aux oscillateurs biologiques qui doivent régler leur période (par exemple, cycle cellulaire ou stimulateur cardiaque dans le nœud sino-auriculaire) (Tsai et al, 2008 ). Ceci est également soutenu par l'analyse mathématique du modèle simple (pour plus de détails, voir Informations supplémentaires).


Rythmes circadiens chez les plantes (avec diagramme)

Faisons une étude approfondie des rythmes circadiens chez les plantes. Après avoir lu cet article, vous en apprendrez plus sur 1. Rythmes endogènes versus exogènes 2. Occurrence des rythmes circadiens chez les plantes 3. Terminologie 4. Établissement de la nature endogène d'un rythme et 5. Horloge biologique.

Introduction aux rythmes circadiens :

Comme tous les autres organismes vivants, les plantes sont et ont toujours été exposées à des changements environnementaux forts et rythmés provoqués par les mouvements planétaires.Par exemple, la rotation de la Terre sur son axe donne lieu au cycle du jour et de la nuit, la révolution de la Terre autour du Soleil donne lieu à une succession de saisons et les mouvements compliqués de la Lune par rapport à la Terre et au Soleil donnent lieu à des mois lunaires et cycles de marée.

Il n'est que naturel que ces rythmicités ou périodicités environnementales trouvent leur contrepartie dans les rythmes biologiques qui contrôlent de nombreuses activités comportementales et physiologiques des organismes vivants, y compris les plantes. Lorsque la période des rythmicités biologiques correspond à celles des cycles du jour et de la nuit, ces rythmes sont appelés rythmes circadiens (Circa = environ diem = un jour).

Le comportement rythmique des plantes dans des conditions naturelles est connu des scientifiques depuis plus de deux mille ans. Les mouvements dits de sommeil (ou mouvements de va-et-vient) des feuilles de certaines plantes comme le haricot (Phaseolus multiflorus) en sont un exemple et parmi les premières observations sur les phénomènes circadiens.

En 1729, l'astronome français De Mairan a réalisé une expérience très importante dans laquelle il a transféré les plantes dans l'obscurité continue d'une cave (une pièce sous une maison) et a observé que les feuilles montraient des mouvements rythmiques de haut en bas pendant plusieurs jours. . Il a conclu que ceux-ci ne dépendaient pas du cycle quotidien de la lumière et de l'obscurité même s'ils étaient normalement synchronisés avec ce dernier. Selon lui, ces mouvements étaient contrôlés par un mécanisme interne et étaient donc endogènes.

Depuis lors, de nombreux biologistes distingués ont enquêté et confirmé ce phénomène, notamment le célèbre physiologiste des plantes Wilhem Pfeffer et Charles et Francis Darwin qui ont consacré un livre complet à "Le pouvoir des mouvements chez les plantes" (1880). Erwin Bunning (1971), qui a étudié les mouvements circadiens des feuilles pendant plus de quatre décennies, croyait que ces mouvements des feuilles n'étaient « qu'une expression de la gentillesse des plantes envers les botanistes, en leur permettant de découvrir et d'enregistrer les rythmes circa­diens au sein de la plante ».

Les découvertes de De Mairan ont marqué le début de l'un des domaines d'étude les plus fascinants et mystérieux (c.

Outre les rythmes circadiens, les organismes ont également développé de nombreuses autres rythmicités endogènes au cours de leur longue histoire évolutive. Les rythmicités ou périodicités dont les périodes correspondent à celles de la lunaison sont appelées rythmes circalunaires (période

29 jours), à ceux de la marée sont appelés rythmes circatidaux (période

12,4 ou 24,8 heures), à ceux des saisons sont appelés rythmes circaannuels (période

par an) ou à ceux du temps entre les basses eaux printanières successives sont appelés rythmes circa semi-lunaires (période

Les rythmes endogènes non circadiens avec des périodes comparativement très courtes de quelques minutes à quelques heures sont appelés rythmes ultradiens. Cependant, parmi tous ceux-ci, les rythmes circadiens sont les plus connus. Sur la base des observations de Bunning et Tazawa (1957), une illustration du rythme circadien dans les feuilles primaires de Phaseolus multiflorous est donnée sur la figure 22.1.

Rythmes endogènes versus exogènes :

La découverte de De Mairan a conduit à l'établissement ferme de la distinction entre les concepts de rythmes endogènes et exogènes. Les rythmes exogènes trouvés dans de nombreuses plantes se produisent dans des conditions naturelles, mais ils ne persistent pas dans un environnement uniforme car ils sont contrôlés uniquement par un paramètre environnemental.

Par exemple, la rythmicité observée dans la décharge de spores dans les cultures du champignon Pilobolus crystallinus dans des conditions naturelles est perdue si les cultures sont transférées dans des conditions environnementales uniformes. D'autre part, comme mentionné précédemment, les rythmes endogènes ne dépendent pas des paramètres environnementaux bien qu'ils puissent être synchronisés avec eux.

Il est maintenant généralement admis que les plantes (et autres organismes) présentant des rythmes circadiens endogènes (ou d'autres types) ont un système de mesure du temps ou une horloge biologique à l'intérieur de leurs cellules qui mesure le passage du temps de la même manière qu'un pendule.

Occurrence des rythmes circadiens chez les plantes :

Des rythmes circadiens ont été trouvés chez certains membres de presque tous les grands groupes de plantes, à l'exception des Bryophytes et des Gymnospermes. Certains des exemples de rythmes circadiens chez les plantes sont donnés dans le tableau 22.1.

Terminologie / Définitions :

Afin de discuter des rythmes circadiens (ou d'autres types) chez les plantes, il est d'abord nécessaire de se familiariser avec les termes communs habituellement rencontrés en bio-chronométrie.

Rythme biologique endogène avec une période approximative de 24 heures. et pas exactement 24 heures. Habituellement, il se situe entre 21 et 28 heures.

Mouvement rythmique tel que le mouvement de haut en bas des feuilles de certaines plantes comparable au mouvement de balancement d'un pendule.

La période du rythme est le temps après lequel une phase définie d'oscillation se reproduit, c'est-à-dire, par exemple, le temps entre des pics ou des creux successifs.

C'est l'état instantané d'une oscillation au cours d'une période.

Un seul déplacement d'une oscillation le long de l'axe du temps suite à une perturbation (perturbation). Il peut s'agir soit d'une avance (+ ∆Ø) soit d'un retard (-∆Ø).

C'est la mesure dans laquelle la réponse observée varie par rapport à la moyenne. Dans le cas d'un pendule, c'est la moitié de la longueur de la balançoire.

C'est la synchronisation d'une oscillation biologique (rythme) avec un zeitgeber (un paramètre environnemental fluctuant rythmiquement) afin qu'ils aient tous les deux la même période.

Période de fonctionnement libre (r) :

La période d'un oscillateur ou d'un rythme endogène dans des conditions environnementales uniformes, c'est-à-dire en l'absence d'un zeitgeber, par exemple à température constante, et dans une obscurité continue ou une lumière continue.

C'est un mot allemand qui signifie donneur de temps. C'est l'oscillation forçante qui entraîne une oscillation biologique, par exemple les cycles environnementaux de la lumière et de la température, de la marée, du clair de lune et de la saison. En d'autres termes, il s'agit d'un paramètre environnemental fluctuant de manière rythmique - un synchroniseur.

Une ou plusieurs périodes temporairement raccourcies ou allongées survenant à la suite d'une perturbation par une lumière ou une impulsion de température.

Dans la plupart des rythmes circadiens des plantes maintenues dans des conditions environnementales uniformes, il y a une diminution progressive de leur amplitude avec le temps. C'est ce qu'on appelle l'amortissement. Certaines des caractéristiques des rythmes circadiens endogènes sont illustrées à la figure 22.2.

Établissement de la nature endogène d'un rythme :

Un rythme doit satisfaire l'ensemble suivant de cinq règles ou conditions qui ont d'abord été proposées par Pittendrigh (1954), avant de pouvoir être qualifié d'endogène :

1. La période de rythme ne doit pas être exactement de 24 heures. (C'est parce que la période de rythme de course libre ne doit pas correspondre exactement aux oscillations connues dans l'environnement).

2. Le rythme doit se poursuivre dans des conditions environnementales maintenues aussi constantes qu'il est physiquement possible.

3. La phase du rythme doit pouvoir être décalée et la nouvelle phase conservée par la suite dans des conditions environnementales uniformes.

4. Le rythme doit être initié par un seul stimulus.

5. La phase du rythme doit être retardée dans des conditions anaérobies (hypoxie).

Les trois premières des cinq conditions ou règles ci-dessus sont particulièrement importantes et si l'une d'entre elles n'est pas satisfaite, il est peu probable qu'un rythme circadien soit véritablement endogène. En revanche, si la troisième condition évoquée ci-dessus peut être remplie par une démonstration nette de déphasage, le caractère endogène du rythme est presque assurément établi.

Horloge biologique:

Les plantes présentant des rythmes circadiens endogènes ont un système de mesure du temps ou « horloge biologique » à l'intérieur de leurs cellules qui mesure le passage du temps de la même manière qu'un pendule. La nature et le fonctionnement de l'horloge biologique ne sont pas encore clairement compris.

Il existe cependant plusieurs preuves de la participation possible de :

(i) Physiologie membranaire, organites cytoplasmiques ou

(ii) La synthèse des noyaux et des protéines ou

(iii) Oscillations biochimiques à plus haute fréquence dans les cellules.

En conséquence, différents modèles ont été proposés par les scientifiques pour expliquer le fonctionnement de l'oscillateur circadien. Par exemple, dans le modèle Chronon, les 24 heures. La période correspond au temps nécessaire à la transcription d'une hypothétique séquence linéaire d'ADN, cistron par cistron.

Selon un modèle membranaire, cette période est attribuée aux processus plus lents impliqués dans la fusion latérale des protéines avec la bicouche lipidique. Selon un autre modèle, la période circadienne serait le résultat d'interactions entre des oscillations biochimiques à plus haute fréquence au sein de la cellule.

L'emplacement de l'horloge biologique n'est pas non plus clair dans les cellules. Étant donné que les rythmes circadiens ne sont pas observés dans les extraits acellulaires ou les organites cellulaires isolés, il est probable que l'horloge biologique ne se trouve pas dans la cellule, mais la cellule entière elle-même agit probablement comme l'horloge biologique.


Matériaux et méthodes

Oligonucléotides d'ADN et enzymes

La séquence de toutes les molécules d'ADN et les séquences de transcription d'ARN attendues ont été choisies pour minimiser l'apparition de structures secondaires alternatives, vérifiées par le programme de repliement de l'ADN et de l'ARN du groupe de Vienne (Flamm et al, 2000 ). Les séquences peuvent être trouvées dans la section 4 des informations supplémentaires et la figure supplémentaire S1. Tous les oligonucléotides d'ADN ont été synthétisés et purifiés par PAGE ou HPLC par Integrated DNA Technologies. T21-nt a été marqué avec un fluorophore Texas Red à l'extrémité 5', T12-nt a été marqué avec un fluorophore TAMRA à l'extrémité 5', A1 et A2 ont été marqués avec des quenchers Iowa Black-RQ à l'extrémité 3'. L'ARN polymérase T7 (mélange d'enzymes), le tampon de transcription et le NTP dans le cadre du kit T7 Megashortscript et E. coli La RNase H a été achetée auprès d'Ambion. A noter que selon le brevet du fabricant (# 5,256,555), le mix enzymatique contient de la pyrophosphatase pour prolonger la durée de vie de la réaction de transcription car la pyrophosphatase est impliquée dans la régulation de l'alimentation de nos circuits transcriptionnels et n'est pas directement impliquée dans la dynamique, nous négligeons cela enzyme dans nos modèles et ne l'appelons pas une « enzyme essentielle » pour la dynamique du circuit.

Transcription

Les matrices de commutation (brins T-nt et T-t) ont été hybridées avec 10 % (v/v) de tampon de transcription 10 x de 90 à 20 °C pendant 1 h à cinq fois les concentrations finales utilisées. Aux modèles recuits, nous avons ajouté 15 % (v/v) 75 mM chaque NTP (1,5 fois la quantité suggérée du kit), 8 % (v/v) 10 × tampon de transcription, 5 % (v/v) 300 mM MgCl2, et de l'eau pour remplir le volume. La concentration de NTP a été augmentée pour tenter de prolonger la durée de vie de la réaction discontinue et le Mg 2+ supplémentaire a été ajouté pour équilibrer les NTP chargés négativement. Les réactions de transcription pour les expériences au spectrofluoromètre ont été réalisées à un volume total de 60 µl dans une cuvette en quartz. Une fois les signaux de fluorescence collectés pendant 5 min, les activateurs d'ADN (A1 et A2) des stocks à forte concentration (50 M) ont été ajoutés et mélangés dans la cuvette. Après 10 min, l'inhibiteur d'ADN dI1 a été ajouté à partir d'un stock de 50 M et mélangé. Après 10 min, des signaux d'ARN purifiés ont été ajoutés à partir de stocks de 30 M et mélangés, pour les conditions de réaction qui utilisaient des signaux d'ARN initiaux. Quinze minutes après l'ajout de tous les brins d'ADN ss et signaux d'ARN, 4 à 11 % (v/v) d'ARNA ont été ajoutés et mélangés, 1 min après quoi 0,35 à 2,1 % (v/v) de RNase H ont été ajoutés et mélangés. Les données de fluorescence utilisées dans le texte et les informations supplémentaires révèlent les traces de fluorescence une fois l'ajout d'enzyme terminé. Les concentrations nominales citées par le fabricant (stock RNAP = 1,25 µM et stock RNase H = 1,25 µM) ont été utilisées comme concentrations stock enzymatiques. Les conditions de réaction et les concentrations finales estimées d'enzymes sont répertoriées dans les tableaux supplémentaires S5 à S7. Des échantillons ont été prélevés à des intervalles de 30 min (ou comme indiqué sur les figures 3 et 5) pour des études sur gel et les réactions de transcription ont été stoppées par l'ajout de colorant dénaturant (80% formamide, 10 mM EDTA, 0,01 g XCFF).

Afin d'essayer d'obtenir de meilleures oscillations en évitant le grand transitoire initial et d'explorer la dynamique du système à partir de différentes conditions initiales, certaines expériences ont été lancées avec de l'ARN présent avant l'ajout d'enzymes. Pour la purification des signaux d'ARN pour ces expériences et pour les contrôles de gel, des brins latéraux de matrice pleine longueur (le complément de T-nt plutôt que de Tt) ont été utilisés pour préparer des matrices d'ADN entièrement duplex pour rA1 (qui est rI1 dans l'oscillateur Design III ) et rI2. Les réactions de transcription ont été préparées sous la forme d'un volume total de 60 l avec 0,2 M de matrices d'ADN entièrement duplex. Les conditions de transcription étaient les mêmes que ci-dessus, sauf que 20 % (v/v) de RNAP ont été utilisés et que la RNase H a été omise. Après une incubation de 6 h à 37°C, le mélange réactionnel a été traité avec 2,5 pi de DNase I pendant 30 min pour éliminer les matrices d'ADN, et arrêté par l'ajout d'un colorant dénaturant. Le mélange réactionnel a été passé sur un gel dénaturant à 8 %. Les bandes d'ARN ont été excisées et éluées du gel par la méthode d'écrasement et de trempage, précipitées à l'éthanol et remises en suspension dans l'eau.

L'acquisition des données

Pour les expériences au spectrofluoromètre, l'excitation et l'émission pour le T12 marqué au TAMRA étaient à 559 nm et 580 nm, tandis que l'excitation et l'émission pour le T21 marqué au rouge Texas étaient à 597 nm et 615 nm. La fluorescence a été enregistrée toutes les minutes à l'aide d'un spectrofluoromètre SPEX Fluorolog-3 (Jobin Yvon) et convertie en activité de commutation (pourcentage de commutation à l'état OFF) en se normalisant par rapport à la fluorescence minimale (mesurée avant l'ajout d'enzymes avec un excès d'activateurs marqués par extincteur) et fluorescence maximale (mesurée en fin de réaction après addition d'inhibiteurs d'ADN en excès pour déplacer les activateurs).

Des gels de polyacrylamide dénaturants (8 % 19:1 acrylamide:bis et 7 M d'urée dans du tampon TBE) ont été laissés à fonctionner pendant 50 min avec 10 V/cm à 65°C dans du tampon TBE (100 mM Tris, 90 mM acide borique, 1 mM EDTA). Les gels non dénaturants (10 % 19:1 d'acrylamide/bis dans du tampon TAE/Mg) ont été laissés à couler pendant 100 min avec 13 V/cm à 35°C dans du tampon TAE contenant 12,5 mM de Mg 2+ (40 mM de Tris- Acétate, 1 mM d'EDTA, 12,5 mM de Mg-acétate, pH 8,0). L'échelle d'ADNdb à 10 bases (Invitrogen) a été utilisée dans la piste de marquage et les gels ont été colorés avec de l'or SYBR (Molecular Probes) pour la quantification. Les données de gel ont été recueillies sur un scanner de gel Molecular imager FX (BioRad) et mesurées à l'aide de l'outil de boîte rectangulaire et de l'outil de profil de voie du progiciel Quantity One (BioRad). L'outil de boîte rectangulaire compte la fluorescence totale dans une boîte dessinée autour de la bande de gel d'intérêt, avec soustraction automatique des densités de bande moyennes d'une boîte de fond, tandis que l'outil de profil de piste compte la fluorescence à chaque pixel sur une piste. Pour la conception I, une correction de fond a été effectuée en ce qui concerne les régions entre les bandes T21-nt (T23-nt pour la conception III) et T12-t, à l'exception des ARN dans les voies de contrôle, pour lesquelles une correction de fond a été effectuée dans les voies de contrôle. Une correction de fond a été effectuée pour chaque gel séparément.

Les concentrations de rI2 dans les gels dénaturants pour l'oscillateur Design I ont été mesurées à l'aide de l'outil de boîte rectangulaire, en se normalisant par rapport aux densités de bandes de rI2 (62 bases) dans les voies de contrôle qui contenaient 1 M de rA1 purifié (67 bases) et de rI2 (62 bases) . Dans de nombreux cas, les bandes rA1 (67 bases) n'étaient pas significativement au-dessus du bruit de fond ou étaient masquées par les queues des bandes rI2 lors de l'analyse à l'aide de l'outil de profil de voie. Quantifier les concentrations de rA1 en présence de fortes concentrations de rI2 conduirait à une surestimation des concentrations de rA1 en raison des contributions importantes des queues des bandes de rI2, nous avons donc choisi de ne pas quantifier les concentrations de bandes de rA1. Les déchets w35 (∼35 bases) ont été normalisés au niveau de signal rI2 dans les voies de contrôle car la coloration est à peu près linéaire en longueur, cela sous-estime la concentration, et parce qu'il existe de nombreuses autres longueurs de déchets que nous n'avons pas mesurées, nous rapportons les concentrations de déchets dans « arbitraire unités» (au Figure supplémentaire S5). Les concentrations de commutation à l'état OFF dans les gels non dénaturants ont été mesurées à l'aide de l'outil de boîte rectangulaire par rapport aux densités de bandes dans les voies de contrôle contenant 1 M chacune des commutateurs à l'état OFF T12 et T21 (figure supplémentaire S6).

Les concentrations d'ARN dans les gels dénaturants pour l'oscillateur Design III nécessitaient des méthodes de mesure plus soigneuses car les trois bandes se chevauchaient quelque peu. Comme le montre la figure supplémentaire S11, l'alignement des profils de voies basé sur trois brins de matrice (T12-t, T31-t et T23-t) peut affecter les pics d'ARN à rI1, rI2 et rI3. Étant donné que rI3 (64 bases) migre à proximité de rI2 (62 bases) et ne peut pas être distingué sans ambiguïté à l'aide de l'outil de boîte rectangulaire, nous avons choisi de modéliser les trois bandes d'ARN dans les profils de voies sous forme de pics gaussiens et d'ajuster leurs hauteurs en tant que mesure des concentrations d'ARN. Les 1 M des bandes rI1 et rI2 dans les voies de contrôle étaient bien décrites par deux pics gaussiens de cinq pixels de large. En utilisant les résultats de l'alignement pour attribuer les emplacements centraux de rI1 et rI3 à 15 pixels d'intervalle et ceux de rI1 et rI2 à 20 pixels d'intervalle, les hauteurs des trois pics gaussiens ont été ajustées simultanément par un code MATLAB personnalisé à l'aide du recherche fmin fonction. Pour la normalisation, les hauteurs ajustées de rI1 et rI2 dans les voies de contrôle avec les mêmes emplacements centraux et largeurs ont été utilisées. Parce que la coloration est à peu près linéaire en longueur, la fluorescence de l'or SYBR de rI3 a été supposée être la moyenne de celles de rI1 et rI2.

Simulation de modèle

Les simulations cinétiques et les ajustements de paramètres ont été implémentés dans MATLAB. Les équations différentielles ont été résolues en utilisant le ode23s fonction. Pour l'ajustement des paramètres, nous avons utilisé une fonction de coût utilisant les erreurs des moindres carrés des trajectoires de fluorescence, des résultats de gel et des caractéristiques d'oscillation (amplitude d'oscillation, fréquence et coefficient d'amortissement) entre les résultats de simulation et les expériences. La fonction de coût a été minimisée en utilisant le fmincon fonction. Les détails des paramètres expérimentaux et des équations du modèle se trouvent dans Informations supplémentaires. Les fichiers MATLAB et SBML sont disponibles en tant qu'informations supplémentaires. Les fichiers SBML ont été soumis à la base de données BioModels (http://www.ebi.ac.uk/biomodels/) avec les numéros d'accession MODEL1012090000 à MODEL1012090006.


Circuit génétique oscillant : une horloge fiable pour votre microbiome

Les colonies de bactéries contenant le circuit du répressilateur développent différents modèles de « anneaux de croissance » au fil du temps en fonction du stade où se trouvait le circuit du répressilateur lorsque la bactérie de la graine de chaque colonie a commencé à se développer. Crédit : Paulson Lab et Wyss Institute de l'Université Harvard

L'oscillateur génétique enregistre les changements dans les modèles de croissance du microbiome in vivo.

Malgré toute l'attention portée au microbiome humain au cours des dernières années, un aspect de ces recherches fait rarement la une des journaux : la difficulté d'observer comment il évolue au fil du temps en réponse à divers stimuli. La méthode d'analyse la plus courante consiste à extraire les bactéries d'échantillons fécaux, puis à séquencer leurs génomes, mais cette approche, bien que peu invasive, perd des informations cruciales sur l'endroit et le moment où les changements bactériens se produisent dans l'intestin, fournissant aux scientifiques une image incomplète de la dynamique de la microbiote.

Désormais, un nouvel outil créé par des chercheurs du Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de l'Université Harvard et de la Harvard Medical School (HMS) apporte une solution à ce problème sous la forme d'un ensemble de gènes bactériens qui ont été conçus pour détecter et enregistrer les changements. dans la croissance de différentes populations de bactéries au fil du temps dans les intestins de souris vivantes avec une précision unicellulaire, et peut servir de plate-forme pour des diagnostics et des thérapies complexes basés sur la biologie synthétique pour une variété d'applications dans l'intestin. L'étude a été publiée aujourd'hui, le 11 octobre 2019, dans Communication Nature.

Garder le temps

Le système utilise un circuit génétique oscillant, appelé répressilateur, comme une sorte d'horloge génétique pour mesurer la croissance bactérienne. Le répressilateur est constitué de trois gènes bactériens qui codent pour trois protéines (tetR, cl et lacI), dont chacun bloque l'expression de l'une des autres protéines. Les gènes sont liés dans une boucle de rétroaction négative, de sorte que lorsque la concentration de l'une des protéines répressives tombe en dessous d'un certain niveau, la protéine qu'elle réprimait est exprimée, ce qui bloque l'expression de la troisième protéine, et le processus se répète dans une mode cyclique.

Ce gif en accéléré montre comment le motif des anneaux fluorescents change au fur et à mesure que le cycle du répressilateur progresse au cours de la croissance d'une colonie bactérienne. Crédit : Silver Lab et Wyss Institute de l'Université Harvard

Lorsque les trois gènes sont insérés dans un plasmide et introduits dans des bactéries, le nombre de cycles de boucle de rétroaction négative terminés peut servir d'enregistrement du nombre de divisions cellulaires subies par les bactéries. Chaque fois que les bactéries se divisent, toutes les protéines répresseurs présentes dans leur cytoplasme sont diluées, de sorte que leur concentration diminue progressivement et déclenche l'expression de la protéine suivante dans le cycle du répressilateur. Surtout, le cycle du répressilateur se répète après 15,5 générations bactériennes, quelle que soit la vitesse ou la lenteur de la croissance des bactéries. Cela lui permet d'agir comme une mesure objective du temps, un peu comme une horloge ou une montre.

« Imaginez si vous aviez deux personnes portant deux montres différentes et que la trotteuse de la montre d'une personne se déplaçait deux fois plus vite que celle de l'autre personne », a expliqué le premier auteur David Riglar, Ph.D., un ancien post-doctorant au Wyss Institute et au HMS qui dirige maintenant un groupe de recherche en tant que Sir Henry Dale Fellow à l'Imperial College de Londres. « Si vous arrêtiez les deux montres après une heure, elles ne seraient pas d'accord sur l'heure qu'il était, car leur mesure du temps varie en fonction de la vitesse du mouvement de la trotteuse. En revanche, notre répressilateur est comme une montre qui se déplace toujours à la même vitesse, donc quel que soit le nombre de personnes différentes qui en portent une, elles donneront toutes une mesure cohérente du temps. Cette qualité nous permet d'étudier plus précisément le comportement des bactéries dans l'intestin.”

Les chercheurs ont couplé chacune des trois protéines de répresseur à une molécule fluorescente de couleur différente et ont développé un flux de travail d'imagerie appelé RINGS (Inférence de croissance basée sur le répresseur au niveau d'une cellule) pour suivre quelle protéine est exprimée à différents moments au cours de la bactérie. 8217s de croissance. "Au fur et à mesure qu'une colonie bactérienne se développe vers l'extérieur, le circuit du répressilateur crée ces différentes signatures fluorescentes en forme d'anneau d'arbre en fonction de la protéine répresseur active dans la seule bactérie qui a démarré la colonie", a déclaré Riglar. "Le motif des anneaux fluorescents enregistre le nombre de cycles de répressilateur qui se sont produits depuis le début de la croissance, et nous pouvons analyser ce motif pour étudier comment les taux de croissance varient entre différentes bactéries et dans différents environnements."

À l'aide de RINGS, l'équipe a réussi à suivre les divisions cellulaires dans plusieurs espèces bactériennes différentes cultivées in vitro et a observé que la durée du cycle de répressilateur des bactéries restait constante lorsqu'elles étaient cultivées sur des échantillons extraits d'intestin de souris (pour simuler un complexe microenvironnement) ou exposés à un antibiotique (pour simuler des conditions de stress et des schémas de croissance incohérents).

Ce schéma visuel suit le cycle du répressilateur à travers des échantillons bactériens individuels au fil du temps : l'expression de chacune des protéines du répresseur est représentée par une couleur fluorescente différente. Crédit : Paulson Lab et Wyss Institute de l'Université Harvard

Suivi du changement

Pour évaluer les performances du répressilateur in vivo, l'équipe a administré par voie orale à des souris E. coli contenant le circuit du répressilateur, puis analysé les bactéries extraites d'échantillons fécaux. Le répressilateur est resté actif jusqu'à 16 jours après l'introduction, montrant que l'expression génique oscillatoire à long terme pouvait être maintenue dans les bactéries intestinales des mammifères vivants. L'analyse RINGS a détecté avec succès des changements dans les schémas de croissance bactérienne, et les bactéries dont les circuits de répressilateur étaient à différents stades pourraient être «synchronisées» en donnant aux souris un composé dans leur eau de boisson qui a arrêté le cycle de répressilateur à un stade donné.

Enfin, les chercheurs ont testé la capacité du répressilateur à détecter les différences de taux de croissance bactérienne observées à la suite d'une inflammation intestinale. Les souris ont reçu un composé induisant une inflammation, suivi de bactéries chargées de répressilateur. Après 15 heures, l'analyse RINGS a montré que les bactéries des souris atteintes d'inflammation avaient des répressilateurs dans une plus large gamme de phases par rapport aux bactéries des souris témoins, suggérant que l'inflammation produit un environnement qui entraîne des incohérences dans la croissance bactérienne, conduisant potentiellement à des déséquilibres dans le microbiome intestinal. .

"Ce répressilateur nous permet de vraiment sonder les subtilités du comportement bactérien dans l'intestin vivant, non seulement dans les états sains et malades, mais aussi dans l'espace et le temps", a déclaré l'auteur correspondant Pamela Silver, Ph.D., qui est membre principal du corps professoral du Wyss Institute et professeur de biochimie et de biologie des systèmes Elliot T. et Onie H. Adams au HMS. « Le fait que nous puissions resynchroniser le répressilateur lorsqu'il est déjà dans l'intestin, ainsi que le maintenir sans avoir besoin d'administrer des antibiotiques sélectifs, signifie également que nous pouvons étudier le microbiome dans un état plus naturel avec un minimum de perturbations .”

En plus de comprendre la dynamique du microbiome, le répressilateur ouvre le potentiel de diagnostics et de thérapies complexes basés sur la biologie synthétique pour l'intestin humain. Les applications potentielles incluent la création d'un système programmé pour initier une cascade de transcription de gènes à un certain point du rythme circadien, ou un diagnostic qui enregistre le temps écoulé après la détection d'un biomarqueur donné.

"Non seulement cette recherche résout un problème spécifique lié à la surveillance des changements dynamiques de la physiologie du microbiome dans l'intestin vivant, mais elle fournit une plate-forme qui pourrait conduire à de tout nouveaux types de diagnostics et même à des thérapies dépendantes du temps", a déclaré Wyss Founding Directeur Donald Ingber, MD, Ph.D., qui est également professeur de biologie vasculaire Judah Folkman au HMS et au programme de biologie vasculaire du Boston Children’s Hospital, ainsi que professeur de bio-ingénierie à la John A. Paulson School de Harvard de l'Ingénierie et des Sciences Appliquées.

Les autres auteurs de l'article incluent David Richmond, Laurent Potvin-Trottier, Andrew Verdegaal, Somenath Bakshi, Emanuele Leoncini, Lorena Lyon et Johan Paulsson de HMS, et Alexander Naydich du Wyss Institute, HMS et Harvard’s John A. Paulson École d'ingénieurs et sciences appliquées. Cette recherche a été soutenue par une bourse à long terme du programme Human Frontier Science, la Menzies Foundation, le Wellcome Trust, la National Science Foundation, la Defense Advanced Research Projects Agency, la Harvard Medical School et le Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering.

Référence : "Variabilité bactérienne dans l'intestin des mammifères capturée par un oscillateur synthétique à cellule unique" par David T. Riglar, David L. Richmond, Laurent Potvin-Trottier, Andrew A. Verdegaal, Alexander D. Naydich, Somenath Bakshi, Emanuele Leoncini, Lorena G. Lyon, Johan Paulsson et Pamela A. Silver, 11 octobre 2019, Communication Nature.
DOI : 10.1038/s41467-019-12638-z


7 équations de phase

L'équation de phase décrit la dynamique de la différence de phase entre un oscillateur à fonctionnement libre soumis à un signal de forçage externe. Le verrouillage de phase se produit pendant l'entraînement, où la différence de phase entre le signal de forçage et les phases forcées de l'oscillateur doit maintenir une valeur stable. L'équation de phase peut être utilisée pour déterminer le verrouillage de phase, et donc l'entraînement et les glissements de phase. Dans la partie suivante de cette section, nous expliquons cela en détail.

7.1 Dérivation de l'équation de phase mise à l'échelle

L'entraînement pour le modèle déterministe et stochastique des rythmes circadiens a été étudié et discuté dans [48], et ils ont étudié en détail l'effet du bruit moléculaire sur les phénomènes de verrouillage de phase et de glissement de phase. Nous fournissons ci-dessous les équations que nous utilisons pour déterminer la nature des entraînements tels que le verrouillage de phase et les glissements de phase à partir des données de la série chronologique pour une période de forçage donnée.

Nous considérons et , respectivement, les phases instantanées en radians des oscillations externes (forçage) et forcées qui régissent les oscillateurs circadiens. La différence de phase est (20) (21) (22) Notez que nous avons pris le temps en heures (h). Pour obtenir la période, nous prenons , et nous substituons ceci dans l'équation ci-dessus pour obtenir (23) où et sont la période de forçage du signal et de l'oscillateur forcé, respectivement. ont une valeur constante dans le temps, alors que varie dans le temps, et la procédure de calcul sera discuté dans la section 7.2. Nous mettons à l'échelle (23) et réduisons à l'adimensionnel en prenant et et l'équation mise à l'échelle est (24) (25) Si on prend la constante être radians alors l'équation ci-dessus devient (26) C'est l'équation de phase sans dimension que nous utilisons pour calculer le glissement de phase. Pour calculer le taux de glissement de phase par jour (), nous modifions l'équation ci-dessus comme (27) où est la période moyenne de l'oscillateur forcé, et il est donné comme avec m étant le nombre de cycles. Notez la différence entre (26) et (27), et nous utilisons ces deux équations dans la section suivante pour calculer la région de verrouillage de phase et de glissements de phase pour le paramètre donné ainsi que la série chronologique pour le modèle de mouche des fruits.

7.2 Numériques de l'équation de phase : verrouillage de phase et glissement de phase

Pour calculer le glissement de phase, nous calculons la période pour chaque cycle en utilisant HT et supposons que la période est constante pour un cycle complet d'oscillation, nous prenons cette période comme une période instantanée () pour un cycle complet comme le montre la figure 10. Nous calculons le glissement de phase en intégrant (26) par la méthode d'Euler avec une étape d'intégration de , qui est le même que le temps d'échantillonnage de la série chronologique. Nous calculons le glissement de phase à partir de la série temporelle que nous obtenons à partir du modèle de mouche des fruits [ 10 ] et des données expérimentales que nous avons obtenues de la culture de souris SCN [ 32 ] pour illustrer l'efficacité de notre nouvelle méthode.

Calcul du glissement de phase

(une) Les séries temporelles sont obtenues à partir du modèle, (b) La phase instantanée est calculée via HT. La période de chaque cycle est calculée comme indiqué dans la section 3, et cette période est désignée comme la période instantanée () pour un cycle (c), (ré) Cette période instantanée obtenue est utilisée pour calculer le glissement de phase en l'acheminant vers (26). Cette équation est intégrée numériquement via la méthode d'Euler. Tel qu'utilisé dans [ 10 ], est la concentration caractéristique de l'ARNm (M)

7.2.1 Glissement de phase calculé pour la série temporelle obtenue à partir du modèle de mouche des fruits

Nous utilisons deux périodes de forçage 23 et 25 h pour illustrer le verrouillage de phase et les glissements dans le modèle de la mouche des fruits [ 10 ]. En forçant l'amplitude , le modèle oscille avec une période de fonctionnement libre de 24,2 h. Un glissement de phase de 1,2 h est obtenu si la période de forçage est de 23 h et selon (27), le taux de glissement de phase par jour (24 h) est de 1,19 h. Nous calculons également le taux de glissement de phase par jour pour différentes valeurs de une avec une période de forçage de 23 h et parcelle de contre une est montré dans la Fig. 11 une. Il existe une valeur critique de une au-dessous duquel le glissement de phase se produit, et au-dessus duquel l'oscillateur forcé est complètement verrouillé en phase sur le signal externe appliqué. On répète aussi ceci au signal de forçage avec une période de 25 h. Lorsque , un glissement de phase se produit et il est de -0,8 h et le taux de glissement de phase par jour est de -0,79 h. On obtient à nouveau le taux de glissement de phase par jour pour différentes valeurs une avec période de forçage 25 h et le tracé de contre une est montré dans la Fig. 11 c.

Diagrammes d'entraînement. versus a pour Tyson et al. [ 10 ] modèle avec une période de signal de forçage de

(une) 23h et, (c) 25 heures. Les points calculés s'affichent dans les points bleus. Le "signe d'addition" rouge et le "signe de multiplication" vert sont les points correspondants de la langue d'Arnold 1:1 (b), (ré) Série temporelle du modèle avec une période de signal de forçage de 23 h et une valeur d'amplitude . Le modèle n'est pas complètement verrouillé et, à chaque cycle, il affiche un temps de crête différent concernant le signal de forçage externe. La ligne pointillée noire indique le temps de pointe de la variable M, (e) Glissement de phase calculé pour un signal de forçage de période 23 h et photopériode 11,5 h pendant 300 jours. Lorsque , aucun verrouillage ne se produit, et pour les valeurs non nulles de une, il montre la tendance périodique au blocage, (F) Glissement de phase calculé pour un signal de forçage de période 25 h et photopériode 12,5 h, (g) Série temporelle du modèle avec une période de signal de forçage de 25 h et une valeur d'amplitude . Tel qu'utilisé dans [ 10 ], est la concentration caractéristique de l'ARNm (M)

Nous intégrons également numériquement (26) pour calculer le glissement de phase et le verrouillage pour différents une valeurs avec deux signaux de forçage différents de période 23 et 25 h. Les résultats sont montrés dans les Fig. 11 e et F, respectivement, pour divers une valeurs. Nous sélectionnons spécifiquement quatre une valeurs, trois de la région de non-entraînement, et une de la région d'entraînement comme le montre la Fig. 11 b (le « signe d'addition » rouge et le « signe de multiplication » vert). Dans la figure 11 e, la période du signal de forçage est de 23 h, lorsque (sans signal de forçage), progression du glissement à vitesse constante (ligne bleue). Lorsque , le système présente une tendance périodique au blocage (lignes noires et vertes). Lorsque , le système est complètement verrouillé en phase (, ligne rouge). Séries temporelles correspondantes pour sont illustrés à la Fig. 11 . On observe des résultats similaires pour la période de forçage de 25 h (Figs. 11 F et g).

Pour voir l'effet du bruit moléculaire sur l'entraînement, nous utilisons la série temporelle stochastique du Tyson et al. modéliser avec une période de forçage de 23 h et calculer le glissement de phase à l'aide de (26). Les résultats sont illustrés à la Fig. 12. Lorsque et , l'entraînement est observé pour les valeurs plus élevées de une (Fig. 12 une et b). Pour (Fig. 12 b), le glissement de phase que nous avons obtenu à partir des simulations stochastiques correspond bien à la simulation déterministe (Fig. 11 e). Cela indique que le modèle est robuste au bruit et que sa propriété d'entraînement au signal de forçage externe est similaire à celle du modèle déterministe à condition que est assez grand.

Effet du bruit moléculaire sur l'entraînement. L'effet du bruit moléculaire sur la version stochastique de Tyson et al. modèle avec

(une) et, (b) . Dans toutes les simulations, la période de forçage du signal est de 23 h


Quelqu'un peut-il expliquer cela?

C'est ce que je vois sur la lunette.

La base de temps est de 50uS.
Si le délai est raccourci à 50uS, je vois ceci,

J'ai commencé avec un 16F18346 puis j'ai changé pour un 16F18446 mais cela n'a fait aucune différence.
Je l'ai alimenté à partir de PK4 et d'une alimentation séparée - aucune différence.
WDT est désactivé.

L'oscilloscope a une sortie de 1 kHz qu'il montre comme une onde carrée parfaite.

Quelqu'un a-t-il une idée de ce qui pourrait causer cela?
J'espère avoir fait quelque chose de vraiment stupide pour pouvoir continuer.

Augustinetez

Membre actif

Pommie

Membre bien connu

Il garantit que la sortie reste élevée et ne déclenche pas l'oscilloscope. J'ai un pullup de 10k sur la broche. J'ai oublié de mentionner, j'ai essayé C0,1,2 et B4 avec le même résultat.

Nigel Goodwin

Super Modérateur

L'oscilloscope a une sortie de 1 kHz qu'il montre comme une onde carrée parfaite.

Quelqu'un a-t-il une idée de ce qui pourrait causer cela?

Pommie

Membre bien connu

Je viens de l'éteindre et aucune différence. Merci quand même.

Pépé

Membre bien connu

Nigel Goodwin

Super Modérateur

Je viens de l'éteindre et aucune différence. Merci quand même.

N'a-t-il pas accéléré la montée et la chute ?. Je suppose que votre lunette est assez rapide ? - d'après mon expérience, SLR ON donne les côtés inclinés comme le vôtre, et SLR OFF restaure les côtés carrés normaux. Avec SLR ON, vous rencontrez des problèmes avec SPI, etc.

Je vois que vous ne l'exécutez qu'une seule fois, si vous placez les lignes hautes/basses à la fin dans une boucle continue, que se passe-t-il ?.

Pommie

Membre bien connu

Notez que la boucle est de 8 itérations et que la portée affiche 10 creux. Certains larges, certains étroits. Il n'y a pas d'autre code. Je suis complètement perplexe. J'ai même démonté le code au cas où.

Les Jones

Membre bien connu

Merci Nigel pour cette astuce. Je ne savais pas que le PIC16F18446 avait un contrôle de vitesse de balayage. Je n'ai utilisé le PIC16F18446 que pour deux projets et ils n'impliquaient pas de sorties à commutation rapide, donc pour eux le fait qu'il soit activé par défaut n'avait pas d'importance. L'astuce pourrait m'éviter de courir après le problème dans de futurs projets.

Sagor1

Membre actif

Nigel Goodwin

Super Modérateur

Merci Nigel pour cette astuce. Je ne savais pas que le PIC16F18446 avait un contrôle de vitesse de balayage. Je n'ai utilisé le PIC16F18446 que pour deux projets et ils n'impliquaient pas de sorties à commutation rapide, donc pour eux le fait qu'il soit activé par défaut n'avait pas d'importance. L'astuce pourrait m'éviter de courir après le problème dans de futurs projets.

J'ai utilisé le 446 pour un projet au travail - et je suis tombé sous le coup du problème du reflex, en utilisant la portée (tout comme Pommie) a montré les mêmes côtés en pente, et une petite lecture de la fiche technique a révélé que le reflex était activé par défaut.

Pommie - avez-vous essayé d'utiliser une broche d'E/S différente, pour confirmer que ce n'est pas un périphérique qui utilise la broche ?.


Voir la vidéo: EB#173 Introduction: LOscillateur HF et BF (Janvier 2022).