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3.1 : ADN recombinant, réaction en chaîne par polymérase et applications à la structure et à la fonction des gènes eucaryotes - Biologie


Des méthodes pour purifier certaines protéines abondantes ont été développées au début du 20e siècle, et certaines des expériences sur la structure fine du gène (colinéarité du gène et de la protéine pour trpA et tryptophane synthase) ont utilisé la génétique microbienne et le séquençage des protéines. Cependant, les méthodes pour isoler les gènes n'ont été développées que dans les années 1960 et n'étaient applicables qu'à quelques gènes.

Tout cela a changé à la fin des années 1970 avec le développement de la technologie de l'ADN recombinant, ou clonage moléculaire. Cette technique a permis aux chercheurs d'isoler n'importe quel gène de n'importe quel organisme à partir duquel on pouvait isoler de l'ADN (ou ARN) intact. Le plein potentiel de fournir un accès à tous les gènes des organismes est maintenant en train d'être réalisé au fur et à mesure que les génomes complets sont séquencés. L'un des sous-produits de l'enquête intense sur les molécules d'ADN individuelles après l'avènement de l'ADN recombinant était une procédure pour isoler tout ADN dont on connaît la séquence. Cette technique, appelée réaction en chaîne par polymérase (PCR), est beaucoup plus simple que les méthodes traditionnelles de clonage moléculaire et est devenue un incontournable de nombreux laboratoires des sciences de la vie. Après avoir couvert les techniques de base de la technologie de l'ADN recombinant et de la PCR, leur application aux études de la structure et de la fonction des gènes eucaryotes sera discutée.

Comme de nombreuses avancées en génétique moléculaire, la technologie de l'ADN recombinant a ses racines dans la génétique bactérienne.

Phage transducteur

Les premiers gènes isolés étaient des gènes bactériens qui pouvaient être captés par le bactériophage. En isolant ces bactériophages hybrides, l'ADN du gène bactérien pourrait être récupéré sous une forme hautement enrichie. C'est le principe de base de la technologie de l'ADN recombinant.

Certains bactériophages s'intégreront dans un chromosome bactérien et résideront dans un état dormant (Figure 3.1). L'ADN du phage intégré est appelé un prophage, et la bactérie est maintenant un lysogène. Les phages qui font cela sont lysogène. L'induction du lysogène entraînera l'excision du prophage et la multiplication pour produire de nombreux descendants, c'est-à-dire qu'il entre dans un lytique phasedans lequel les bactéries sont brisées et détruites. La nomenclature est descriptive. Les bactéries porteuses du prophage ne présentent aucun signe évident du phage (à l'exception de l'immunité à la surinfection avec le même phage, abordée plus loin dans la quatrième partie), mais lorsqu'elles sont induites (par exemple par un stress ou un rayonnement UV), elles génmanger un lytic, d'où ils sont appelés lysogènes. Les lysogènes induits fabriquent des phages à partir du prophage qui a été intégré. Les phages qui se multiplient toujours lorsqu'ils infectent une cellule sont appelés lytique.

L'excision d'un prophage d'un lysogène est ne pastoujours précis. Habituellement, seul l'ADN du phage est coupé du chromosome bactérien, mais occasionnellement, un peu d'ADN hôte adjacent est inclus avec l'ADN du phage excisé et encapsidé dans la descendance. Ces transduire phage sont généralement biologiquement inactifs parce que le morceau du chromosome bactérien remplace une partie du chromosome du phage; ceux-ci peuvent être propagés en présence de phages auxiliaires qui fournissent les gènes manquants lorsqu'ils sont co-infectés dans la même bactérie. Lorsque l'ADN du phage transducteur est inséré dans la cellule nouvellement infectée, les gènes bactériens peuvent recombiner dans le chromosome hôte, apportant ainsi de nouveaux allèles ou même de nouveaux gènes et modifiant génétiquement la cellule infectée. Ce processus est appelé transduction.

Graphique 3.1. Transfert de gènes bactériens par transduction : un phage transducteur lac+ peut convertir une souche lac en lac+ par infection (et croisement ultérieur).

Notez que les phages transducteurs portent un ou un petit nombre de gènes bactériens. C'est une façon de isoler les gènes. Le gène bactérien du phage transducteur a été séparé des 4000 autres gènes bactériens (en E. coli). En isolant un grand nombre de phages transducteurs, l'ADN du phage, y compris les gènes bactériens, peut être obtenu en grand quantitéspour l'investigation biochimique. On peut isoler des quantités de mg ou de mg d'une seule molécule d'ADN, ce qui permet une détermination structurelle précise et une enquête détaillée.

UNE transduction généralisée phagepeut s'intégrer à de nombreux endroits différents sur le chromosome bactérien. L'excision imprécise de l'un de ces emplacements génère un phage de transduction particulier, portant de courtes sections du génome bactérien adjacent au site d'intégration. Ainsi, un phage transducteur généralisé tel que P1 peut capter de nombreuses parties différentes du E. coli génome.

UNE transduction spécialisée phages'intègre dans un seul ou très peu de sites du génome hôte. Par conséquent, il ne peut transporter que quelques gènes bactériens spécifiques, par exemple, l lac(Figure 3.2).

Graphique 3.2. Un exemple d'un phage transducteur portant une partie du lacopéron.

Ce processus d'isolement d'un gène bactérien particulier sur un phage transducteur est imité dans technologie de l'ADN recombinant, dans lequel un gène ou un fragment de génome de n'importe quel organisme est isolé sur un phage ou un plasmide recombinant.


17.1 Biotechnologie

Dans cette section, vous explorerez les questions suivantes :

  • Quels sont les exemples de techniques de base utilisées pour manipuler le matériel génétique (ADN et ARN) ?
  • Quelle est la différence entre le clonage moléculaire et reproductif ?
  • Quels sont les exemples d'utilisation de la biotechnologie en médecine et en agriculture ?

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Avez-vous mangé des céréales pour le petit-déjeuner ou des tomates dans votre salade pour le dîner ? Connaissez-vous quelqu'un qui a reçu une thérapie génique pour traiter une maladie comme le cancer? Votre école, votre assurance maladie ou votre employeur devraient-ils avoir accès à votre profil génétique ? Comprendre le fonctionnement de l'ADN a permis aux scientifiques de recombiner des molécules d'ADN, de cloner des organismes et de produire des souris qui brillent dans le noir. Nous avons probablement mangé des aliments génétiquement modifiés et savons comment l'analyse ADN est utilisée pour résoudre des crimes. La manipulation de l'ADN par l'homme a donné naissance à des bactéries capables de protéger les plantes des insectes nuisibles et de restaurer les écosystèmes. Les biotechnologies ont également été utilisées pour produire de l'insuline, des hormones, des antibiotiques et des médicaments qui dissolvent les caillots sanguins. La génomique comparative donne de nouvelles connaissances sur les relations entre les espèces, et les séquences d'ADN révèlent notre constitution génétique personnelle. Cependant, la manipulation de l'ADN s'accompagne de responsabilités sociales et éthiques, soulevant des questions sur ses utilisations appropriées.

Les acides nucléiques peuvent être isolés des cellules pour analyse en lysant les membranes cellulaires et en détruisant par voie enzymatique toutes les autres macromolécules. Les chromosomes fragmentés ou entiers peuvent être séparés sur la base de la taille (longueur des paires de bases) par électrophorèse sur gel. De courtes séquences d'ADN ou d'ARN peuvent être amplifiées en utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR). La technologie de l'ADN recombinant peut combiner l'ADN de différentes sources en utilisant des plasmides bactériens ou des virus comme vecteurs pour transporter des gènes étrangers dans les cellules hôtes, ce qui donne des organismes génétiquement modifiés (OGM). Les bactéries transgéniques, les plantes agricoles telles que le maïs et le riz et les animaux de ferme produisent des produits protéiques tels que des hormones et des vaccins qui profitent aux humains. (Il est important de se rappeler que la technologie recombinante est possible parce que le code génétique est universel et que les processus de transcription et de traduction sont fondamentalement les mêmes dans tous les organismes.) Le clonage produit des copies génétiquement identiques d'ADN, de cellules ou même d'organismes entiers ( clonage reproductif). Les tests génétiques identifient les gènes pathogènes, et la thérapie génique peut être utilisée pour traiter ou guérir une maladie héréditaire. Cependant, des questions émergent de ces technologies, notamment la sécurité des OGM et les problèmes de confidentialité.

Les informations présentées et les exemples mis en évidence dans la section soutiennent les concepts décrits dans la grande idée 3 du cadre du programme d'études en biologie AP ® . Les objectifs d'apprentissage énumérés dans le cadre du programme d'études fournissent une base transparente pour le cours de biologie AP ®, une expérience de laboratoire basée sur l'enquête, des activités pédagogiques et des questions d'examen AP ®. Un objectif d'apprentissage fusionne le contenu requis avec une ou plusieurs des sept pratiques scientifiques.

Grande idée 3 Les systèmes vivants stockent, récupèrent, transmettent et répondent aux informations essentielles aux processus de la vie.
Compréhension durable 3.A Les informations héréditaires assurent la continuité de la vie.
Connaissances essentielles 3.A.1 L'ADN, et dans certains cas l'ARN, est la principale source d'informations héréditaires.
Pratique scientifique 6.4 L'étudiant peut faire des déclarations et des prédictions sur des phénomènes naturels sur la base de théories et de modèles scientifiques.
Objectif d'apprentissage 3.5 L'étudiant peut justifier l'affirmation selon laquelle les humains peuvent manipuler des informations héréditaires en identifiant un exemple de technologie couramment utilisée.
Grande idée 3 Les systèmes vivants stockent, récupèrent, transmettent et répondent aux informations essentielles aux processus de la vie.
Compréhension durable 3.C Le traitement de l'information génétique est imparfait et est une source de variation génétique.
Connaissances essentielles 3.C.1 Les changements de génotype peuvent entraîner des changements de phénotype.
Pratique scientifique 7.2 L'étudiant peut connecter des concepts dans et entre des domaines pour généraliser ou extrapoler dans et/ou entre des compréhensions durables et/ou de grandes idées.
Objectif d'apprentissage 3.24 L'étudiant est capable de prédire comment un changement de génotype, lorsqu'il est exprimé sous forme de phénotype, fournit une variation qui peut être soumise à la sélection naturelle.

Les questions du défi de la pratique scientifique contiennent des questions de test supplémentaires pour cette section qui vous aideront à vous préparer à l'examen AP. Ces questions portent sur les normes suivantes :
[APLO 3.13][APLO 3.23][APLO 3.28][APLO 3.24][APLO 1.11][APLO 3.5][APLO 4.2][APLO 4.8]

La biotechnologie est l'utilisation d'agents biologiques pour le progrès technologique. La biotechnologie a été utilisée pour l'élevage du bétail et des cultures bien avant que la base scientifique de ces techniques ne soit comprise. Depuis la découverte de la structure de l'ADN en 1953, le domaine de la biotechnologie s'est rapidement développé grâce à la recherche universitaire et aux entreprises privées. Les principales applications de cette technologie sont en médecine (production de vaccins et d'antibiotiques) et en agriculture (modification génétique des cultures, par exemple pour augmenter les rendements). La biotechnologie a également de nombreuses applications industrielles, telles que la fermentation, le traitement des marées noires et la production de biocarburants.

Techniques de base pour manipuler le matériel génétique (ADN et ARN)

Pour comprendre les techniques de base utilisées pour travailler avec les acides nucléiques, rappelez-vous que les acides nucléiques sont des macromolécules constituées de nucléotides (un sucre, un phosphate et une base azotée) liés par des liaisons phosphodiester. Les groupes phosphate sur ces molécules ont chacun une charge négative nette. Un ensemble complet de molécules d'ADN dans le noyau s'appelle le génome. L'ADN a deux brins complémentaires liés par des liaisons hydrogène entre les bases appariées. Les deux brins peuvent être séparés par exposition à des températures élevées (dénaturation de l'ADN) et peuvent être réannelés par refroidissement. L'ADN peut être répliqué par l'enzyme ADN polymérase. Contrairement à l'ADN, qui est situé dans le noyau des cellules eucaryotes, les molécules d'ARN quittent le noyau. Le type d'ARN le plus couramment analysé est l'ARN messager (ARNm) car il représente les gènes codant pour les protéines qui sont activement exprimés. Cependant, les molécules d'ARN présentent d'autres défis à l'analyse, car elles sont souvent moins stables que l'ADN.

Extraction d'ADN et d'ARN

Pour étudier ou manipuler les acides nucléiques, l'ADN ou l'ARN doit d'abord être isolé ou extrait des cellules. Diverses techniques sont utilisées pour extraire différents types d'ADN (Figure 17.2). La plupart des techniques d'extraction d'acide nucléique impliquent des étapes pour ouvrir la cellule et utiliser des réactions enzymatiques pour détruire toutes les macromolécules qui ne sont pas souhaitées (telles que la dégradation des molécules indésirables et la séparation de l'échantillon d'ADN). Les cellules sont brisées à l'aide d'un tampon de lyse (une solution qui est principalement un détergent) lyse signifie "se séparer". Ces enzymes séparent les molécules lipidiques dans les membranes cellulaires et les membranes nucléaires. Les macromolécules sont inactivées à l'aide d'enzymes telles que les protéases qui dégradent les protéines et les ribonucléases (ARNases) qui dégradent l'ARN. L'ADN est ensuite précipité à l'aide d'alcool. L'ADN génomique humain est généralement visible sous la forme d'une masse blanche gélatineuse. Les échantillons d'ADN peuvent être conservés congelés à –80°C pendant plusieurs années.

L'analyse de l'ARN est effectuée pour étudier les modèles d'expression génique dans les cellules. L'ARN est naturellement très instable car les ARNases sont couramment présentes dans la nature et très difficiles à inactiver. Semblable à l'ADN, l'extraction d'ARN implique l'utilisation de divers tampons et enzymes pour inactiver les macromolécules et préserver l'ARN.

Électrophorèse sur gel

Parce que les acides nucléiques sont des ions chargés négativement à pH neutre ou basique dans un environnement aqueux, ils peuvent être mobilisés par un champ électrique. L'électrophorèse sur gel est une technique utilisée pour séparer des molécules sur la base de la taille, en utilisant cette charge. Les acides nucléiques peuvent être séparés sous forme de chromosomes entiers ou de fragments. Les acides nucléiques sont chargés dans une fente près de l'électrode négative d'une matrice de gel poreux semi-solide et tirés vers l'électrode positive à l'extrémité opposée du gel. Les molécules plus petites se déplacent à travers les pores du gel plus rapidement que les molécules plus grosses. Cette différence de vitesse de migration sépare les fragments en fonction de leur taille. Il existe des échantillons étalons de poids moléculaire qui peuvent être analysés avec les molécules pour fournir une comparaison de taille. Les acides nucléiques dans une matrice de gel peuvent être observés à l'aide de divers colorants fluorescents ou colorés. Des fragments d'acide nucléique distincts apparaissent sous forme de bandes à des distances spécifiques du sommet du gel (l'extrémité de l'électrode négative) sur la base de leur taille (figure 17.3). Un mélange de fragments d'ADN génomique de différentes tailles apparaît sous la forme d'un long frottis, alors que l'ADN génomique non coupé est généralement trop gros pour traverser le gel et forme une seule grande bande au sommet du gel.

Amplification de fragments d'acide nucléique par réaction en chaîne par polymérase

Bien que l'ADN génomique soit visible à l'œil nu lorsqu'il est extrait en masse, l'analyse de l'ADN nécessite souvent de se concentrer sur une ou plusieurs régions spécifiques du génome. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique utilisée pour amplifier des régions spécifiques de l'ADN pour une analyse plus approfondie (Figure 17.4). La PCR est utilisée à de nombreuses fins dans les laboratoires, telles que le clonage de fragments de gènes pour analyser des maladies génétiques, l'identification d'ADN étranger contaminant dans un échantillon et l'amplification d'ADN pour le séquençage. Des applications plus pratiques incluent la détection de maladies génétiques.

Des fragments d'ADN peuvent également être amplifiés à partir d'une matrice d'ARN dans un processus appelé PCR à transcriptase inverse (RT-PCR). La première étape consiste à recréer le brin matrice d'ADN d'origine (appelé ADNc) en appliquant des nucléotides d'ADN à l'ARNm. Ce processus est appelé transcription inverse. Cela nécessite la présence d'une enzyme appelée transcriptase inverse. Une fois l'ADNc fabriqué, une PCR régulière peut être utilisée pour l'amplifier.

LIEN VERS L'APPRENTISSAGE

Approfondissez votre compréhension de la réaction en chaîne de la polymérase en cliquant sur cet exercice interactif.

  1. Le processus de PCR peut isoler un morceau particulier d'ADN pour la copie, ce qui permet aux scientifiques de copier des millions de brins d'ADN en peu de temps.
  2. Le processus de PCR peut purifier un morceau particulier d'ADN, et de très petites quantités d'ADN peuvent être utilisées pour la purification.
  3. Le processus de PCR sépare et analyse l'ADN et ses fragments, ce qui nécessite très peu d'ADN.
  4. Le processus de PCR hybride les molécules d'ADN à des brins d'ADN complémentaires, ce qui maintient la même quantité d'ADN.

Hybridation, Southern Blot et Northern Blot

Des échantillons d'acide nucléique, tels que des extraits d'ADN et d'ARN génomiques fragmentés, peuvent être sondés pour la présence de certaines séquences. De courts fragments d'ADN appelés sondes sont conçus et marqués avec des colorants radioactifs ou fluorescents pour faciliter la détection. L'électrophorèse sur gel sépare les fragments d'acide nucléique en fonction de leur taille. Les fragments dans le gel sont ensuite transférés sur une membrane en nylon dans une procédure appelée buvardage (Figure 17.5). Les fragments d'acide nucléique qui sont liés à la surface de la membrane peuvent ensuite être sondés avec des séquences de sonde spécifiques marquées par radioactivité ou fluorescence. Lorsque l'ADN est transféré sur une membrane en nylon, la technique est appelée Southern blotting , et lorsque l'ARN est transféré sur une membrane en nylon, on l'appelle Northern blotting . Les Southern blots sont utilisés pour détecter la présence de certaines séquences d'ADN dans un génome donné, et les Northern blots sont utilisés pour détecter l'expression des gènes.

Clonage moléculaire

En général, le mot «clonage» signifie la création d'une réplique parfaite, mais en biologie, la recréation d'un organisme entier est appelée «clonage reproductif». Bien avant que des tentatives ne soient faites pour cloner un organisme entier, les chercheurs ont appris à reproduire des régions ou des fragments souhaités du génome, un processus appelé clonage moléculaire.

Le clonage de petits fragments du génome permet la manipulation et l'étude de gènes spécifiques (et de leurs produits protéiques) ou de régions non codantes de manière isolée. Un plasmide (également appelé vecteur) est une petite molécule d'ADN circulaire qui se réplique indépendamment de l'ADN chromosomique. Dans le clonage, les molécules plasmidiques peuvent être utilisées pour fournir un "dossier" dans lequel insérer un fragment d'ADN souhaité. Les plasmides sont généralement introduits dans un hôte bactérien pour la prolifération. Dans le contexte bactérien, le fragment d'ADN du génome humain (ou du génome d'un autre organisme à l'étude) est appelé ADN étranger, ou transgène, pour le différencier de l'ADN de la bactérie, qui est appelé le ADN hôte.

Les plasmides sont présents naturellement dans les populations bactériennes (telles que Escherichia coli) et ont des gènes qui peuvent apporter des traits favorables à l'organisme, tels que la résistance aux antibiotiques (la capacité à ne pas être affecté par les antibiotiques). Les plasmides ont été réutilisés et conçus comme vecteurs pour le clonage moléculaire et la production à grande échelle de réactifs importants, tels que l'insuline et l'hormone de croissance humaine. Une caractéristique importante des vecteurs plasmidiques est la facilité avec laquelle un fragment d'ADN étranger peut être introduit via le site de clonage multiple (MCS). Le MCS est une courte séquence d'ADN contenant plusieurs sites qui peuvent être coupés avec différentes endonucléases de restriction couramment disponibles. Les endonucléases de restriction reconnaissent des séquences d'ADN spécifiques et les coupent de manière prévisible, elles sont naturellement produites par les bactéries en tant que mécanisme de défense contre l'ADN étranger. De nombreuses endonucléases de restriction effectuent des coupes décalées dans les deux brins d'ADN, de sorte que les extrémités coupées ont un surplomb monocaténaire de 2 ou 4 bases. Parce que ces surplombs sont capables de recuit avec des surplombs complémentaires, ceux-ci sont appelés « extrémités collantes ». L'ajout d'une enzyme appelée ADN ligase rejoint définitivement les fragments d'ADN via des liaisons phosphodiester. De cette manière, tout fragment d'ADN généré par clivage par endonucléase de restriction peut être épissé entre les deux extrémités d'un ADN plasmidique qui a été coupé avec la même endonucléase de restriction (figure 17.6).

Molécules d'ADN recombinant

Les plasmides contenant de l'ADN étranger sont appelés molécules d'ADN recombinant car ils sont créés artificiellement et n'apparaissent pas dans la nature. Ils sont également appelés molécules chimériques car l'origine de différentes parties des molécules peut être retracée à différentes espèces d'organismes biologiques ou même à la synthèse chimique. Les protéines qui sont exprimées à partir de molécules d'ADN recombinant sont appelées protéines recombinantes. Tous les plasmides recombinants ne sont pas capables d'exprimer des gènes. L'ADN recombinant peut devoir être déplacé dans un vecteur (ou hôte) différent qui est mieux conçu pour l'expression génique. Les plasmides peuvent également être modifiés pour exprimer des protéines uniquement lorsqu'ils sont stimulés par certains facteurs environnementaux, afin que les scientifiques puissent contrôler l'expression des protéines recombinantes.


ADN recombinant et génie génétique Chapitre 16 Impacts

Impacts, enjeux : riz doré ou Frankenfood ? § Les scientifiques ont créé du riz transgénique (Golden Rice) comme supplément de vitamine A pour les pays sous-alimentés. Est-ce que le bénéfice en vaut le risque dans ces sources alimentaires manipulées par les gènes ?

16.1 Clonage d'ADN § Le processus d'ajout de gènes à des aliments ou à d'autres types de cellules est simple en principe § Les chercheurs découpent l'ADN de différentes sources, puis collent les fragments résultants ensemble § Les vecteurs de clonage peuvent transporter de l'ADN étranger dans les cellules hôtes

Couper et coller pour de nouvelles combinaisons d'ADN § Enzymes de restriction • Enzymes bactériennes qui coupent l'ADN partout où une séquence nucléotidique spécifique se produit § Queues d'ADN simple brin produites par la même paire de bases d'enzymes de restriction • L'ADN ligase lie les « extrémités collantes » ensemble § ADN recombinant • Composé d'ADN de deux ou plusieurs organismes

Faire de l'ADN recombinant Ceci est particulièrement utile pour introduire des gènes dans une séquence en recherche.

Clonage d'ADN § L'ADN coupé en fragments par des enzymes de restriction est inséré dans des vecteurs de clonage (plasmides) coupés avec la même enzyme § Des vecteurs de clonage avec de l'ADN étranger sont placés dans des cellules hôtes, qui se divisent et produisent de nombreux clones, chacun avec une copie de l'ADN étranger

c. Clonage d'ADN § ADN complémentaire (c. ADN) • ADN fabriqué à partir d'un m. Matrice d'ARN § La transcriptase inverse transcrit m. De l'ARN à l'ADN, formant une molécule hybride • L'ADN polymérase construit une molécule d'ADN double brin qui peut être clonée • Particulièrement utile pour obtenir de l'ADN sans introns.

c. Clonage d'ADN par transcriptase inverse

16. 1 Concepts clés Clonage d'ADN par le laboratoire et les plasmides § Les chercheurs fabriquent régulièrement de l'ADN recombinant en coupant et en collant ensemble l'ADN de différentes espèces § Les plasmides et autres vecteurs peuvent transporter de l'ADN étranger dans les cellules hôtes

Génomes et bibliothèques d'ADN § Génome • L'ensemble du matériel génétique d'un organisme § Les bibliothèques d'ADN sont des ensembles de cellules contenant divers fragments d'ADN clonés • Bibliothèques génomiques (tout l'ADN d'un génome) • c. Bibliothèques d'ADN (tous les gènes actifs dans une cellule)

Sondes utilisées pour l'identification de l'ADN § Sonde • Un fragment d'ADN marqué avec un traceur • Utilisé pour trouver un clone spécifique portant l'ADN d'intérêt dans une bibliothèque de nombreux clones § Hybridation d'acide nucléique • Appariement de bases entre l'ADN de différentes sources • Une sonde s'hybride avec le gène ciblé

Amplification d'ADN à grande échelle : PCR § Réaction en chaîne par polymérase (PCR) • Une réaction cyclique qui utilise une forme d'ADN polymérase tolérante à la chaleur (Taq polymérase) pour produire des milliards de copies d'un fragment d'ADN • Voici comment une seule goutte de sang sur une scène de crime peut devenir suffisamment étendu pour effectuer les tests nécessaires et être toujours disponible pour des tests futurs si nécessaire

PCR en vue d'ensemble § L'ADN à copier est mélangé avec de l'ADN polymérase, des nucléotides et des amorces qui s'apparient avec certaines séquences d'ADN § Les cycles de températures élevées et basses rompent et reforment les liaisons hydrogène entre les brins d'ADN, doublant ainsi la quantité d'ADN dans chaque cycle

16. 2 Concepts clés Aiguilles dans les meules de foin § Les chercheurs manipulent les gènes ciblés en isolant et en faisant de nombreuses copies de fragments d'ADN particuliers

16. 3 Séquençage de l'ADN § Le séquençage de l'ADN révèle l'ordre des bases nucléotidiques dans un fragment d'ADN

Séquençage de l'ADN § L'ADN est synthétisé avec des nucléotides normaux et des didésoxynucléotides marqués de différentes couleurs • Lorsqu'une base marquée est ajoutée, la synthèse d'ADN s'arrête des fragments de toutes longueurs sont créés § L'électrophorèse sépare les fragments d'ADN, chacun se terminant par une base marquée, par longueur • L'ordre des bases colorées est la séquence de l'ADN • La séquence finie est une base de comparaison

16. 4 Empreintes digitales ADN § Un individu peut être distingué de tous les autres sur la base des « empreintes digitales » ADN § La confiance dans les résultats est extrêmement élevée, dans la fourchette habituellement indiquée de un sur plusieurs millions

Empreintes d'ADN § Empreinte d'ADN • Un ensemble unique de séquences d'ADN utilisées pour identifier les individus § Répétitions en tandem courtes (STR) • De nombreuses copies des mêmes séquences de 2 à 10 paires de bases dans une série le long d'un chromosome • Types et nombres de STR varient beaucoup selon les individus

Création d'empreintes d'ADN § La PCR est utilisée pour amplifier l'ADN de régions de plusieurs chromosomes qui ont des STR § L'électrophorèse est utilisée pour séparer les fragments et créer une empreinte d'ADN unique § Les empreintes d'ADN ont de nombreuses applications • Affaires juridiques, médecine légale, études de population

Empreintes ADN : exemple de cas de médecine légale Vous êtes membre du jury. On vous montre cette comparaison préparée des empreintes digitales ADN, avec ID comme indiqué. Voyez si vous pouvez faire correspondre un suspect avec un échantillon de la scène de crime.

16. 3 -16. 4 Concepts clés Déchiffrer des fragments d'ADN § Le séquençage révèle l'ordre linéaire des nucléotides dans un fragment d'ADN § Une empreinte ADN est un ensemble unique de séquences d'ADN d'un individu

16. 5 Étudier les génomes § Comparer la séquence de notre génome avec celle d'autres espèces nous donne un aperçu du fonctionnement du corps humain § Vous connaissez déjà 98 pour cent des mêmes séquences humaines avec celle des chimpanzés § Pourquoi environ 49 pour cent de la même chose entre un banane et un humain ?

Le projet du génome humain § Le séquençage automatisé de l'ADN et la PCR ont permis aux projets du génome humain de séquencer les 3 milliards de bases du génome humain § 28, 976 gènes ont été identifiés, mais tous leurs produits ou fonctions ne sont pas connus § En 2010, gène distinct nombres jusqu'à environ 23 000 selon les meilleures estimations du travail

Le séquençage du génome humain Les ordinateurs ont considérablement accéléré le processus et ont également augmenté la précision.

La génomique est une application en pleine croissance § Génomique : l'étude des génomes • Génomique structurelle • Génomique comparative § L'analyse du génome humain fournit de nouvelles informations sur les gènes et leur fonctionnement • Applications en médecine et dans d'autres domaines • Exemple : mutations APOA 5 et triglycérides

Les puces à ADN ont un avenir § Les puces à ADN • Microarrays de nombreux échantillons d'ADN différents disposés sur une plaque de verre • Utilisés pour comparer les modèles d'expression génique entre des cellules de différents types ou dans différentes conditions • Peut être utilisé pour dépister des anomalies génétiques, des agents pathogènes ou cancer

16. 6 Génie génétique § Génie génétique • Un processus de laboratoire par lequel des changements délibérés sont introduits dans le génome d'un individu § Les organismes génétiquement modifiés les plus courants d'aujourd'hui sont les bactéries et les levures • Sont utilisés dans la recherche, la médecine et l'industrie • Exemple : production d'insuline humaine

OGM – aujourd'hui et plus tard § Organismes génétiquement modifiés (OGM) • Individus contenant des gènes modifiés de la même espèce ou d'une espèce différente • L'avenir aura des problèmes de contrôle majeurs car le développeur d'OGM brevete généralement le processus/le résultat § Organismes transgéniques • Individus contenant des gènes transférés d'une espèce différente (également OGM) • Exemple : Bactéries avec des gènes de méduses

16. 7 Designer Plants by GM § Les plantes cultivées génétiquement modifiées sont répandues aux États-Unis § Mais leur(s) changement(s) conçu(s) peuvent-ils « sauter » à d'autres plantes ou finir par être incorporés dans des animaux mangeant les plantes modifiées ?

Le plasmide Ti - un mécanisme OGM § Plasmide Ti • Plasmide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens • Contient des gènes inducteurs de tumeurs (Ti) • Utilisé comme vecteur pour transférer des gènes étrangers ou modifiés dans les plantes, y compris certaines cultures vivrières

Étapes de transfert de plasmide Ti

Plantes génétiquement modifiées § Les plantes cultivées sont génétiquement modifiées pour produire plus de nourriture à moindre coût • • Résistance aux maladies ou aux herbicides Rendement accru Plantes qui fabriquent des pesticides (gène de la protéine Bt) Résistance à la sécheresse

Controverses sur les OGM § 73 Les cultures OGM sont approuvées pour une utilisation aux États-Unis, avec des centaines d'autres en attente • Maïs, sorgho, coton, soja, canola, luzerne • Gros problème de quelques entreprises faisant presque toute la recherche et la fabrication - peut conduire à un monopole problème à l'avenir § Faits et controverse – vie réelle • Dans les cultures conçues pour la résistance aux herbicides, les mauvaises herbes deviennent résistantes aux herbicides • Les gènes modifiés se propagent dans les plantes sauvages et les cultures non modifiées

Quelques plantes génétiquement modifiées

16. 8 Barnyards biotechnologiques § Des animaux qui seraient impossibles à produire par des méthodes d'élevage traditionnelles sont créés par génie génétique § Cela peut être vraiment bon pour les animaux en voie de disparition § Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés dans la recherche, la médecine et l'industrie

Des souris et des hommes § 1982 : Les premiers animaux transgéniques – des souris avec des gènes pour l'hormone de croissance du rat

Exemples d'animaux transgéniques § Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèles de nombreuses maladies humaines • Des souris utilisées dans des expériences de knock-out § Les animaux génétiquement modifiés fabriquent des protéines avec des applications médicales et industrielles • Des chèvres et des lapins qui fabriquent des protéines humaines • Des animaux d'élevage avec des caractéristiques souhaitables

Certains animaux génétiquement modifiés Ce poulet sans plumes à l'apparence idiote est de loin la possibilité la plus commercialement viable présentée ici. Cela éliminerait une partie coûteuse de la transformation du poulet et pourrait permettre des exploitations avicoles au climat très chaud.

Cellules knock-out et usines d'organes § Les porcs transgéniques contenant des protéines humaines sont une source potentielle d'organes et de tissus pour les greffes chez l'homme • Peut empêcher le rejet par le système immunitaire § Xénotransplantation • Transplantation d'un tissu ou d'un organe d'une espèce à une autre • Valves cardiaques de porc utilisées pour de nombreuses années.

16. 10 humains modifiés ? § En tant que société, nous continuons à travailler sur les implications éthiques de l'application des nouvelles technologies de l'ADN § La manipulation des génomes individuels se poursuit même si nous pesons les risques et les avantages de cette recherche

Thérapie génique - Aider l'individu § Thérapie génique • Transfert d'ADN recombinant dans des cellules du corps pour corriger un défaut génétique ou traiter une maladie • Des vecteurs viraux ou des amas lipidiques insèrent un gène non muté dans les chromosomes d'un individu • Exemples : fibrose kystique, SCID-X 1

S'améliorer grâce à la thérapie génique § 1998 : un vecteur viral a été utilisé pour insérer des gènes IL 2 RG non mutés chez des garçons atteints d'une maladie d'immunodéficience combinée sévère (SCID-X 1) - la fonction immunitaire la plus récupérée

La thérapie génique s'aggrave § Personne ne peut prédire où un gène injecté par un virus s'insérera dans un chromosome - plusieurs garçons de l'étude SCID-X 1 ont développé un cancer § Dans d'autres études, de graves réactions allergiques au vecteur viral lui-même ont entraîné la mort

Se perfectionner au fil du temps § Ingénierie eugénique • Ingénierie des humains pour des traits désirables particuliers, non associés au traitement des troubles

16. 6 -16. 10 concepts clés utilisant les nouvelles technologies de l'OGM § Le génie génétique, la modification dirigée des gènes d'un organisme, est maintenant utilisé dans la recherche, et il est testé dans des applications médicales § Il faut répondre à de nombreuses questions sur l'éthique et les conséquences de la manipulation de l'être humain génome - certains d'entre eux peuvent être résolus par notre gouvernement, mais beaucoup resteront responsables uniquement par l'individu car il ou elle accepte personnellement leur utilisation.


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Ingénierie génétique

Ingénierie génétique est l'altération du génotype d'un organisme à l'aide de la technologie de l'ADN recombinant pour modifier l'ADN d'un organisme afin d'obtenir des traits souhaitables. L'ajout d'ADN étranger sous la forme de vecteurs d'ADN recombinant générés par clonage moléculaire est la méthode la plus courante de génie génétique. L'organisme qui reçoit l'ADN recombinant est appelé un organisme génétiquement modifié (OGM). Si l'ADN étranger introduit provient d'une espèce différente, l'organisme hôte est appelé transgénique. Les bactéries, les plantes et les animaux ont été génétiquement modifiés depuis le début des années 1970 à des fins académiques, médicales, agricoles et industrielles. Aux États-Unis, les OGM tels que le soja Roundup-ready et le maïs résistant à la pyrale font partie de nombreux aliments transformés courants.

Ciblage génétique

Although classical methods of studying the function of genes began with a given phenotype and determined the genetic basis of that phenotype, modern techniques allow researchers to start at the DNA sequence level and ask: “What does this gene or DNA element do?” This technique, called reverse genetics, has resulted in reversing the classic genetic methodology. This method would be similar to damaging a body part to determine its function. An insect that loses a wing cannot fly, which means that the function of the wing is flight. The classical genetic method would compare insects that cannot fly with insects that can fly, and observe that the non-flying insects have lost wings. Similarly, mutating or deleting genes provides researchers with clues about gene function. The methods used to disable gene function are collectively called gene targeting. Gene targeting is the use of recombinant DNA vectors to alter the expression of a particular gene, either by introducing mutations in a gene, or by eliminating the expression of a certain gene by deleting a part or all of the gene sequence from the genome of an organism.


Voir la vidéo: Gene Regulation and the Order of the Operon (Janvier 2022).