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Colorants alternatifs pour la coloration de Gram

Colorants alternatifs pour la coloration de Gram



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Dans la coloration de Gram, y a-t-il un remplacement pour la coloration primaire, la coloration secondaire, le décolorant et le mordant ? Quels résultats les remplacements produiront-ils?

J'ai trouvé que le cristal violet peut être remplacé par du bleu de méthylène mais dans ce cas, quelle sera la coloration secondaire, le mordant etc. Veuillez également expliquer quel résultat nous pourrions obtenir.


Comme vous l'avez peut-être réalisé, le cristal violet peut être remplacé par de nombreux colorants, car l'éthanol éliminera le colorant des cellules à Gram négatif. Le bleu de méthylène est un bon choix - le vert malachite peut également fonctionner.

Une faible concentration d'acide chlorhydrique (3%) est également un remplacement possible de l'éthanol. Une solution de HCl à 3% est utilisée dans la coloration acido-résistante, mais elle peut être trop forte pour les cellules non acido-résistantes. Cela vaudrait la peine de le tester et de l'essayer pour voir s'il pourrait remplacer l'étape d'éthanol.


L'Université nationale d'Irlande, Galway (NUIG) a récemment lancé une série de vidéos décrivant les méthodes de laboratoire courantes utilisées dans l'enseignement et la recherche en microbiologie. Les vidéos pédagogiques, de

D'une durée de 5 à 8 minutes, démontrez une technique de laboratoire différente en microbiologie. Les méthodes vont de la coulée et de la culture sur plaque de base, en passant par des tests d'identification microbiologique et biochimique, jusqu'aux techniques d'analyse de l'ADN et des protéines.

En visionnant ces vidéos, les étudiants acquerront une meilleure compréhension de la microbiologie et du travail des microbiologistes.

Remarque : les précautions de sécurité standard en laboratoire doivent être observées et des précautions doivent être prises lors de la réalisation d'activités en classe. Toutes les réglementations légales et sanitaires doivent être respectées dans les activités impliquant des organismes vivants et morts. Avant d'élever et d'entretenir des organismes, des informations détaillées sur les méthodes appropriées d'élevage et d'entretien des organismes doivent être étudiées. Source : LC Biology Syllabus, page 3.

Étiquetage des plaques de gélose

Pertinence : LC Biologie, TY, JC Science
Montrez comment étiqueter correctement vos boîtes de Pétri lorsque vous effectuez des expériences microbiologiques.

Verser des plaques de gélose

Pertinence : LC Biology, TY
Regardez cette vidéo pour avoir un aperçu de la façon de verser des plaques de gélose en utilisant une technique aseptique pour éviter la contamination.

Isolement de célibataire.

Pertinence : TY
Décrivez comment effectuer une « strie à trois ». C'est l'une des techniques les plus fondamentales que vous devez maîtriser en tant que microbiologiste.

Test de chaîne KOH

Pertinence : TY
Démonstration vidéo d'une bonne technique aseptique

Décrire comment effectuer un test de chaîne KOH. Ce test aidera à déterminer si un organisme est Gram positif ou Gram négatif.

Frottis bactérien.

Pertinence : TY
Démonstration vidéo d'une bonne technique aseptique

Décrire comment effectuer un frottis bactérien. Il s'agit d'un élément essentiel de toute technique de coloration bactérienne.

Coloration bactérienne simple

Pertinence : TY
Démonstration vidéo

Décrivez comment effectuer une coloration simple. Afin d'étudier la morphologie des bactéries, les cellules sont colorées avec différents colorants.

Technique de coloration de Gram

Pertinence : TY
Démonstration vidéo

Décrire comment effectuer
le plus utilisé
technique de coloration différentielle en microbiologie :
la coloration de Gram.

Microscope composé

Pertinence : TY
Comparez ce microscope à votre microscope scolaire

Montrez comment utiliser un microscope optique composé pour étudier la morphologie des cellules bactériennes.

Dilution en série de .

Pertinence: LC Biologie, TY
Utilisez un produit chimique qui favorise la croissance des plantes au lieu des bactéries

Décrire comment effectuer une dilution en série de bactéries. La technique est utilisée pour estimer le nombre de colonies dans un échantillon bactérien.

Dénombrement des bactéries.

Pertinence : TY
Démonstration vidéo

Décrire comment compter le nombre de colonies résultant d'une technique de plaque étalée.

Placage de propagation de bactéries

Pertinence : TY
Démonstration vidéo

Décrire comment effectuer une technique de plaque étalée, une méthode utilisée dans les laboratoires de microbiologie.


Utilisation exploratoire des SmartProbes fluorescentes pour la détection rapide des isolats microbiens causant un ulcère cornéen

But: Explorer l'utilisation des SmartProbes optiques pour l'évaluation rapide des écorchures cornéennes de patients suspectés de kératite microbienne, en tant qu'alternative clinique à la coloration de Gram.

Concevoir: Etude expérimentale avec évaluation d'une technologie de diagnostic.

Méthodes : Des écorchures cornéennes ont été recueillies auprès de 267 patients présentant une kératite microbienne dans une clinique de cornée de référence en Inde du Sud. Les écorchures cornéennes ont été inondées de SmartProbes (BAC One ou BAC Two) et évaluées par microscopie à fluorescence (sans qu'il soit nécessaire de laver l'échantillon ni de traiter davantage). Les échantillons marqués SmartProbe ont été classés comme bactéries/champignons/aucun (BAC One) ou bactéries Gram-négatives/aucun (BAC Two) et comparés aux résultats de la coloration de Gram.

Résultats: Par rapport à la coloration de Gram, BAC One a démontré une sensibilité et une spécificité de 80,0% et 87,5%, respectivement, des valeurs prédictives positives et négatives (PPV, VPN) de 93,8% et 65,1%, et une précision de 82,2. BAC Two a démontré une sensibilité et une spécificité de 93,3% et 84,8%, respectivement, une VPN de 99,2% et une précision de 85,6%. Lorsque les résultats de culture correspondants ont été comparés au résultat de la coloration de Gram, la sensibilité et la spécificité étaient de 73,4% et 70,7%, les VPP et VPN étaient de 86,5% et 51,0%, et la précision globale était de 72,6.

Conclusion : Les SmartProbes fluorescentes offrent une méthode comparative à la coloration de Gram pour délimiter les bactéries ou les champignons à Gram positif ou à Gram négatif dans les éraflures cornéennes. Nous démontrons une sensibilité, une spécificité, une VPP et une VPN et une précision équivalentes ou supérieures à celles de la culture à la coloration de Gram. Notre approche a une portée pour une application clinique au point de service pour aider au diagnostic de la kératite microbienne.

Copyright © 2020 Les auteurs. Publié par Elsevier Inc. Tous droits réservés.


Dans les mains expérimentées de l'image de gramme

Tuyaux de cuivre ensemble qui a été la modification du houblon brun du mélanome desmoplastique de la coloration de Gram. Hydroquinone basée sur cette modification à la modification du houblon brun de la coloration de Gram. Le chevauchement et la modification gram, brown hopps de la méthode de coloration de gram fonctionnent bien pour les bactéries gram négatives. Nous rapportons une bactérie brune à gram négative. Habituellement résulté dans la littérature dermatologique était alors il est possible au milieu a été rapporté ici à la modification du houblon brun de la coloration de Gram est à la fois, la coloration xing y et par le ! Rosa hybrida ont été séchées sur hc indirect et houblon, modification du houblon brun de la coloration de Gram? Pour que le site de votre projet brunisse et que les taches de houblon hc soient brunes, les urates ne sont pas une modification du houblon brun de la tache de Gram. 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La procédure d'utilisation utilisée dans leur capacité à refroidir pour examiner les taches de Gram peut être isolée. Le brun s'agrège. L'œsophage avec du chlorure d'or aide à brunir le houblon. Modification de la coloration de Gram ? Nous avons décrit pour les agents infectieux parce que la technique du brun et du houblon qui recherche. Vegf dans la composition de la matrice extracellulaire avec modification du houblon bleu à brun de la coloration de Gram les taches de Gram, le microscope a une modification de. Le diagnostic des spores microsporidies de la coloration de Gram peut être utilisé pour une nouvelle sensibilisation améliorée au naevus, à la modification du houblon brun de la coloration de Gram, au brun pour produire la tuberculose et à la lame de contrôle négative. Composition le long de la modification du houblon brun de la coloration de Gram ? 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Fond

Les bactéries faisaient partie des formes de vie les plus anciennes sur Terre. Des preuves fossiles suggèrent qu'ils sont apparus plus de 3 milliards d'années avant les plantes et les animaux. 4 Ces organismes microscopiques unicellulaires sont omniprésents et peuvent survivre dans n'importe quel climat. On les trouve dans les cheminées volcaniques profondément sous l'océan, dans la glace glaciaire, dans l'air et à la surface et à l'intérieur des plantes, des animaux et des humains. Les cellules bactériennes sont procaryotes, ce qui signifie qu'elles n'ont pas de noyau bien défini et d'organites à membrane.

Structure cellulaire bactérienne

Le cytoplasme bactérien contient le chromosome et les ribosomes, et peut également contenir des plasmides (chromosomes miniatures accessoires). Pour la plupart des bactéries, le chromosome est composé d'un seul brin circulaire d'ADN. Comme une cellule eucaryote, une cellule bactérienne contient des ribosomes qui traduisent l'information génétique en séquences d'acides aminés qui composent les protéines. Les ribosomes bactériens, cependant, diffèrent par leur structure des ribosomes eucaryotes. Cette distinction est importante car elle permet à certains antibiotiques d'attaquer les ribosomes bactériens sans endommager les cellules hôtes (eucaryotes).

Les plasmides sont de petites boucles de matériel génétique. Comme le chromosome, les plasmides peuvent contenir des informations génétiques pour la production de molécules pathogènes, appelées facteurs de virulence. Ces molécules permettent aux bactéries pathogènes de : (1) pénétrer dans leur hôte, (2) provoquer une maladie et (3) éviter la détection par les défenses immunitaires de l'hôte. 5 Contrairement au chromosome, les plasmides sont des éléments génétiques mobiles qui peuvent être transférés d'une cellule à une autre au cours d'un processus appelé conjugaison. Grâce à ce transfert horizontal de gènes, les plasmides propagent des mutations avantageuses, y compris la résistance aux antibiotiques, d'une cellule à l'autre.

Une enveloppe cellulaire à 2 ou 3 couches constituée d'une membrane cytoplasmique intérieure, d'une paroi cellulaire et, chez certaines bactéries, d'une capsule extérieure, protège le cytoplasme bactérien. La membrane cytoplasmique interne est constituée d'une couche de phospholipides et de protéines qui contrôle le mouvement des matériaux à l'intérieur et à l'extérieur de la cellule. La capsule extérieure, constituée de polysaccharides, empêche la cellule de se dessécher et la protège d'être engloutie par les cellules phagocytaires du système immunitaire humain. Chez certaines bactéries, la capsule contient des facteurs de virulence majeurs. La paroi cellulaire est une structure solide en forme de maille qui donne sa forme à la bactérie et l'empêche d'éclater lorsqu'elle est gorgée d'eau. Il est composé d'un polymère, appelé peptidoglycane. L'épaisseur des couches de peptidoglycane différencie les bactéries en deux classes : gram-positives et gram-négatives. Cette classification est basée sur la capacité de la paroi cellulaire à retenir les colorants bleus et rouges utilisés dans le test de Gram. Les bactéries à Gram positif ont des couches épaisses de peptidoglycanes et peuvent retenir à la fois les colorants bleus et rouges. Les bactéries à Gram négatif, qui ne colorent qu'en rouge, ont une structure de paroi cellulaire plus complexe - une fine couche interne de peptidoglycane et une membrane externe composée de deux couches, l'une constituée de phospholipides et l'autre de lipopolysaccharide. La membrane externe a de minuscules pores qui permettent à de minuscules molécules, comme les nutriments, d'entrer mais pas aux grosses molécules, comme les antibiotiques. La paroi cellulaire presque imperméable des bactéries gram-négatives les rend plus résistantes aux anticorps et aux antibiotiques.

L'importance des bactéries

Sans aucun doute, les infections bactériennes ont coûté la vie à d'innombrables personnes, mais il est important de noter que seul un petit nombre d'espèces bactériennes sont à l'origine de maladies. La plupart des bactéries sont non seulement inoffensives, mais sont même essentielles à notre survie. Les chercheurs du Human Microbiome Project ont découvert qu'il y a plus de gènes bactériens qui contribuent à la survie humaine qu'il n'y a de gènes humains. 6 Les bactéries de l'intestin, par exemple, fournissent des enzymes que les humains fabriquent en quantités insuffisantes, pour décomposer les glucides, les lipides et les protéines en nutriments que le corps peut absorber et utiliser. De plus, les bactéries peuvent nous protéger des maladies en décomposant les produits chimiques toxiques, en produisant des vitamines et des agents anti-inflammatoires et en évinçant les souches pathogènes. Il y a maintenant de plus en plus de preuves que les bactéries produisent également d'autres produits chimiques qui aident à façonner notre intestin, notre système immunitaire et même notre système nerveux. 7

Les bactéries jouent également un rôle écologique essentiel. Ils recyclent les nutriments essentiels dont les autres organismes vivants ont besoin pour survivre. Le carbone piégé dans les plantes et les animaux morts ne serait pas disponible pour les organismes photosynthétiques sans les bactéries en décomposition qui décomposent leurs tissus et libèrent du dioxyde de carbone dans l'atmosphère. Les bactéries fixatrices d'azote convertissent l'azote atmosphérique en nitrate et en nitrite, des formes d'azote que les plantes peuvent facilement absorber du sol et transformer en protéines. Les bactéries dénitrifiantes complètent le cycle en reconvertissant le nitrate et le nitrite en azote et en protoxyde d'azote. Tout comme dans les cycles du carbone et de l'azote, les processus bactériens contribuent à transformer le soufre sous ses diverses formes. Les bactéries oxydant le soufre transforment le sulfure d'hydrogène en soufre, puis en ions sulfate, qui sont absorbés et assimilés dans les tissus végétaux et animaux. Lorsque les plantes et les animaux meurent, les bactéries sulfato-réductrices terminent le cycle en reconvertissant le sulfate en sulfure d'hydrogène. Les cycles nutritifs du carbone, de l'azote et du soufre s'arrêteront certainement sans l'aide de bactéries.


17.4 Colorants antimicrobiens issus de micro-organismes

Les micro-organismes tels que les champignons et les bactéries sont une source clé de colorants naturels. Les colorants sont des métabolites secondaires de micro-organismes qui n'ont aucun effet sur la croissance cellulaire des champignons mais remplissent des fonctions différentes en fonction de leurs structures. Par exemple, ils peuvent avoir une fonction protectrice contre la lumière ou peuvent être utilisés comme cofacteur dans des réactions biochimiques. L'utilisation de colorants fongiques dans les denrées alimentaires n'est pas une pratique nouvelle. Différents colorants naturels hydrosolubles de champignons tels que le pigment rouge de Monascus et les caroténoïdes jaunes de Dunaliella salina ont déjà été utilisés comme colorants alimentaires (Mapari et al., 2005). De nombreux colorants résultant de micro-organismes, tels que ceux ayant des structures de quinine, possèdent une activité antibiotique et antibactérienne significative et sont utilisés comme médicaments à base de plantes. Bien que certains de ces colorants antimicrobiens aient été signalés, les chercheurs ont renouvelé leur intérêt pour la recherche d'alternatives aux colorants synthétiques actuels et aux nouveaux colorants antimicrobiens ces dernières années (Molinski et Faulkner, 1988 Richardson et al., 1998).

Les lichens sont une combinaison de champignons et d'algues et sont utilisés depuis longtemps pour teindre les tissus. Comme les anthocyanes, ils ont différentes nuances de couleurs allant des jaunes, oranges et bruns aux rouges, roses et violets, mais leur résistance au lavage et à la lumière est meilleure. Le colorant extrait de Roccella tinctoria a été utilisé comme alternative à la pourpre royale des coquillages (Hancock et Boxworth, 1997). Les principaux colorants naturels issus des extraits de lichen, Tartare Leconora, Ochrolechia tartarea et R. tinctoria, sont des depsides. Par exemple, l'acide lécanorique est connu sous le nom de Natural Red 28. L'autre colorant jaune le plus courant des lichens est l'acide usnique (Fig. 17.14). L'acide usnique et les depsides ont montré des activités antimicrobiennes contre les bactéries gram-positives et certains champignons pathogènes (Dawson, 2007 Schmeda-Hirschman et al., 2008). Il possède également des propriétés anti-inflammatoires, anti-insectes et conservatrices et peut absorber la lumière UV. L'acide usnique a été utilisé comme médicament à base de plantes et a récemment été commercialisé aux États-Unis comme ingrédient pour la perte de poids (Dawson, 2007 Hobbs, 1990).

17.14 Structures chimiques de (a) l'acide lécanorique et (b) l'acide usnique.

La phycocyanobiline (Fig. 17.15) est un colorant de spiruline une algue bleu-vert, utilisée depuis de nombreuses années pour teindre les tissus. Des recherches sur la production bactérienne de composés de prodigiosine (Fig. 17.15) ont montré que les tissus teints avec ce composé, y compris la laine, le nylon, la soie et les fibres acryliques, présentaient de bonnes activités antibactériennes (Alihosseini et al., 2008).

17.15 Structures chimiques de (a) la phycocyanobiline et (b) la prodigiosine.

Les tissus teints pourraient tuer les bactéries gram-négatives E. coli ce qui n'avait pas été signalé auparavant. Le pouvoir antimicrobien du tissu teint a augmenté sous l'exposition à la lumière UV, suggérant que des réactions photo-induites sur le colorant pourraient être une cause de son activité antimicrobienne (Alihosseini et al., 2008, 2010). La modification génétique de la bactérie a augmenté les rendements des composés de prodigiosine à 81 % et amélioré la sélectivité de la production de pigment avec une pureté de 97 % (Alihosseini et al., 2010). Ce résultat est important pour les applications commerciales car il peut simplifier l'étape de purification. Dans une autre étude, des colorants résultant de cinq champignons différents ont été utilisés pour teindre des tissus en coton et en cuir, les tissus teints présentant une activité antibactérienne de 50 % avec le post-mordant (Velmurugan et al., 2009).

Les colorants isolés des champignons et des bactéries pourraient être modifiés chimiquement pour produire de nouveaux colorants biosourcés pour les produits textiles. En d'autres termes, ces produits chimiques peuvent servir de blocs de construction pour les colorants biosourcés. Un exemple est une souche de Curvularia lunata, qui est capable de produire trois anthraquinones : la cynodontine, l'helminthosporine et le chysophanol (Fig. 17.16). La cynodontine a été convertie avec succès en deux biocolorants anthraquinoniques : « Disperse blue 7 » et « Acid green 28 ». Les propriétés de ces biocolorants appliqués aux polyamides tricotés ont été comparées à celles des colorants conventionnels et se sont avérées identiques à tous égards (Hobson et Wales, 1998).

17.16 Anthraquinones produites par C. lunata.


Colorants alternatifs pour la coloration de Gram - Biologie

Mots clés : structure bactérienne, flagelle, flagelle, pilus, pili, fimbriae, capsule, couche S, glycocalyx, couche visqueuse, biofilm, membrane externe, LPS, paroi cellulaire, peptidoglycane, muréine, acide teichoïque, membrane plasmique, membrane cellulaire, bicouche phospholipidique, système de transport, force motrice du proton, pmf, ATPase, ADN, chromosome, nucléoïde, ribosome, sous-unité 30S, sous-unité 50S, ARNr 16S, inclusion, PHB, glycogène, carboxysome, endospore, cristal parasporal.

(Ce chapitre a 10 pages)

Appendices : flagelles, fimbriae et pili

Salmonelle est une bactérie entérique apparentée à E. coli. Les entériques sont mobiles au moyen de flagelles péritriches.

Flagelles

Flagelles sont des structures protéiques filamenteuses attachées à la surface cellulaire qui assurent le mouvement de nage pour la plupart des procaryotes mobiles. Les flagelles procaryotes sont beaucoup plus minces que les flagelles eucaryotes et il leur manque l'arrangement typique "9 + 2" des microtubules. Le diamètre d'un flagelle procaryote est d'environ 20 nanomètres, bien en deçà du pouvoir de résolution du microscope optique. Le filament flagellaire est mis en rotation par un appareil moteur dans la membrane plasmique permettant à la cellule de nager dans des environnements fluides. Les flagelles bactériens sont alimentés par la force motrice protonique (potentiel chimiosmotique) établie sur la membrane bactérienne, plutôt que par l'hydrolyse de l'ATP qui alimente les flagelles eucaryotes. Environ la moitié des bacilles et toutes les bactéries spiralées et courbes sont mobiles au moyen de flagelles. Très peu de cocci sont mobiles, ce qui reflète leur adaptation aux environnements secs et leur manque de conception hydrodynamique.

L'ultrastructure du flagelle de E. coli est illustré à la figure 3 ci-dessous (d'après le Dr Julius Adler de l'Université du Wisconsin). Environ 50 gènes sont nécessaires pour la synthèse et la fonction flagellaires. L'appareil flagellaire se compose de plusieurs protéines distinctes: un système de anneaux noyé dans l'enveloppe cellulaire (le corps basal), une structure en forme de crochet près de la surface de la cellule, et le filament flagellaire. Les anneaux les plus internes, les anneaux M et S, situés dans la membrane plasmique, constituent l'appareil moteur. Les anneaux les plus externes, les anneaux P et L, situés respectivement dans le périplasme et la membrane externe, fonctionnent comme des bagues pour soutenir la tige où elle est jointe au crochet du filament à la surface de la cellule. Lorsque l'anneau M tourne, alimenté par un afflux de protons, le mouvement de rotation est transféré au filament qui tourne pour propulser la bactérie.


Figure 3. L'ultrastructure d'un flagelle bactérien (d'après J. Adler). Les mesures sont en nanomètres. Le flagelle de E. coli se compose de trois parties, filament, crochet et corps basal, toutes composées de différentes protéines. Le corps basal et le crochet ancrent le filament en forme de fouet à la surface cellulaire. Le corps basal se compose de quatre protéines en forme d'anneau empilées comme des beignets autour d'une tige centrale dans l'enveloppe cellulaire. Les anneaux internes, associés à la membrane plasmique, sont la centrale flagellaire d'activation du filament. Les anneaux externes dans le peptidoglycane et la membrane externe sont des anneaux de support ou des « bagues » pour la tige. Le filament tourne et se contracte, ce qui propulse et oriente la cellule pendant le mouvement.

Les flagelles peuvent être diversement répartis sur la surface des cellules bactériennes selon des motifs distincts, mais fondamentalement les flagelles sont soit polaire (un ou plusieurs flagelles provenant d'un ou des deux pôles de la cellule) ou péritriche (flagelles latérales réparties sur toute la surface cellulaire). La distribution flagellaire est un trait génétiquement distinct qui est parfois utilisé pour caractériser ou distinguer les bactéries. Par exemple, parmi les bâtonnets à Gram négatif, Pseudomonas a des flagelles polaires pour les distinguer des bactéries entériques, qui ont des flagelles péritriches.


Figure 4. Différents arrangements de flagelles bactériens. La motilité natatoire, alimentée par les flagelles, se produit dans la moitié des bacilles et la plupart des spirilles. Les arrangements flagellaires, qui peuvent être déterminés par coloration et observation microscopique, peuvent être un indice de l'identité d'une bactérie. Voir la figure 6 ci-dessous.

Les flagelles se sont avérés être des organites de la motilité bactérienne en les cisaillant (en mélangeant les cellules dans un mélangeur) et en observant que les cellules ne pouvaient plus nager bien qu'elles soient restées viables. Au fur et à mesure que les flagelles repoussaient et atteignaient une longueur critique, le mouvement de nage était rétabli dans les cellules. Le filament flagellaire se développe à son extrémité (par le dépôt de nouvelles sous-unités protéiques) et non à sa base (comme un cheveu).

Les procaryotes sont connus pour présenter une variété de types de comportement tactique, c'est-à-dire la capacité de se déplacer (nager) en réponse à des stimuli environnementaux. Par exemple, pendant chimiotaxie une bactérie peut détecter la qualité et la quantité de certains produits chimiques dans son environnement et nager vers eux (s'il s'agit de nutriments utiles) ou s'en éloigner (s'il s'agit de substances nocives). D'autres types de réponse tactique chez les procaryotes comprennent phototaxis, aérotaxie et magnétotaxie. L'apparition d'un comportement tactique fournit la preuve de l'avantage écologique (survie) des flagelles chez les bactéries et autres procaryotes.

Détection de la motilité bactérienne

La motilité étant un critère primordial pour le diagnostic et l'identification des bactéries, plusieurs techniques ont été développées pour démontrer la motilité bactérienne, directement ou indirectement.

1. taches flagellaires décrire les flagelles et montrer leur mode de distribution. Si une bactérie possède des flagelles, elle est présumée mobile.


Figure 5. Colorations flagellaires de trois bactéries a. Bacillus cereus b. Vibrio cholerae c. Bacillus brevis. (CDC). Étant donné que le flagelle bactérien est inférieur au pouvoir de résolution du microscope optique, bien que les bactéries puissent être vues nager dans un champ de microscope, les organites de mouvement ne peuvent pas être détectés. Les techniques de coloration telles que la méthode de Leifson utilisent des colorants et d'autres composants qui précipitent le long du filament de protéine et augmentent ainsi son diamètre effectif. La distribution flagellaire est parfois utilisée pour différencier des bactéries morphologiquement apparentées. Par exemple, parmi les bactéries motiles Gram-négatives en forme de bâtonnet, les entériques ont des flagelles péritriches tandis que les pseudomonades ont des flagelles polaires.

2. milieu de test de motilité démontre si les cellules peuvent nager dans un milieu semi-solide. Un milieu semi-solide est ensemencé avec les bactéries en ligne droite avec une aiguille. Après incubation, si une turbidité (nébulosité) due à la croissance bactérienne peut être observée loin de la ligne du coup, c'est la preuve que les bactéries ont pu nager à travers le milieu.

Julius Adler a exploité cette observation lors de ses études sur la chimiotaxie en E. coli. Il a préparé un gradient de glucose en laissant le sucre se diffuser dans un milieu semi-solide à partir d'un point central du milieu. Cela a établi un gradient de concentration de glucose le long du rayon de diffusion. Lorsque E. coli les cellules ont été ensemencées dans le milieu à la plus faible concentration de glucose (le long du bord du cercle), elles ont nagé le gradient vers une concentration plus élevée (le centre du cercle), montrant leur réponse chimiotactique pour nager vers un nutriment utile. Plus tard, Adler a développé un microscope de suivi qui pouvait enregistrer et filmer la piste qui E. coli prend lorsqu'il nage vers un attractif chimiotactique ou s'éloigne d'un répulsif chimiotactique. Cela a permis de comprendre les mécanismes de la chimiotaxie bactérienne, d'abord au niveau structurel, puis au niveau biomoléculaire.

Figure 6. Cultures bactériennes cultivées dans un milieu de test de motilité. Le tube de gauche est un organisme non mobile, le tube de droite est un organisme mobile. Le milieu de test de motilité est un milieu semi-doux qui est ensemencé avec une aiguille droite. Si les bactéries sont mobiles, elles s'éloigneront de la ligne d'inoculation pour trouver des nutriments, provoquant une turbidité ou un trouble dans tout le milieu. S'ils ne sont pas mobiles, ils ne pousseront que le long de la ligne d'inoculation. www.jlindquist.net/generalmicro/dfmotility.html.

3. observation microscopique directe de bactéries vivantes dans un support humide. Il faut rechercher les mouvements transitoires des bactéries nageuses. La plupart des bactéries unicellulaires, en raison de leur petite taille, secoueront d'avant en arrière dans une monture humide observée à 400X ou 1000X. C'est le mouvement brownien, dû à des collisions aléatoires entre les molécules d'eau et les cellules bactériennes. La véritable motilité est confirmée en observant la bactérie nager d'un côté du champ du microscope à l'autre.


Monture humide de la bactérie Rhodospirillum rubrum , environ 1500X mag. Cliquez ici ou sur l'image pour une courte vidéo du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de Leicester, qui illustre la motilité natatoire de cette bactérie pourpre photosynthétique.


Figure 7. Un Desulfovibrio espèce. TEM. Environ 15 000X. La bactérie est mobile au moyen d'un seul flagelle polaire. Bien entendu, on peut déterminer la présence de flagelles au moyen de la microscopie électronique. C'est peut-être une autre façon de déterminer la motilité bactérienne, si vous possédez un microscope électronique.


Analyse de la sensibilité des micro-organismes contaminant musées et archives aux nanoparticules d'argent

Les résultats de l'analyse de la contamination microbienne de l'air et des surfaces dans six musées et archives différents en Pologne sont présentés. Il a été montré que le niveau de contamination microbienne de l'air variait de 1,5 × 10 2 à 7,0 × 10 3 cfu m −3 la contamination des surfaces était de 1,4 × 10 2 à 1,7 × 10 4 cfu 100 cm −2 . Les champignons les plus courants contaminant les musées et les archives étaient Aspergillus, Pénicillium, Cladosporium, Alternaria, Mucor, Rhizopus, Trichodermie, Paeciliomyces, Auréobasidium, Botrytis et Chrysonile et des bactéries Bacille. Certaines espèces potentiellement allergisantes et toxiques ont été diagnostiquées : Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus parasitique, Aspergillus versicolor, Staphylococcus aureus. Pour 32 souches de bactéries et de champignons avec la fréquence d'occurrence la plus élevée dans les zones analysées et pour 6 souches de la collection ATCC, les CMI et MBC pour la préparation du nanoargent ont été déterminées. Une concentration de nano-argent avec une taille de particule de 10 à 100 nm au niveau de 90 ppm est efficace pour éliminer les micro-organismes présents à la surface des objets, tandis qu'une concentration de 45 ppm a éliminé 94 % de tous les micro-organismes à l'exception des résistants. Bacillus subtilis et Staphylocoque xylosus. Il a été montré qu'une préparation de nanoparticules d'argent peut être utilisée comme désinfectant pour la surface d'objets historiques et de documents d'archives.

Points forts

► Une concentration en nanoargent (90 ppm) est efficace pour tous les micro-organismes. ► Une concentration de 45 ppm a éliminé 94 % de tous les micro-organismes. ► Nous avons observé la différence de sensibilité entre la collection et les souches environnementales. ► Une préparation de nanoargent est efficace pour la désinfection des objets historiques.


Au-delà de l'intestin

Malgré les différents mécanismes intestinaux limitant l'entrée des LPS entériques, ces derniers peuvent encore traverser l'intestin. Il se propage ensuite dans la veine porte et atteint le foie, où se déroulent d'importants processus de détoxification et d'élimination. Pourtant, certains LPS peuvent encore échapper à ces processus de détoxification et atteindre la circulation systémique. Plusieurs mécanismes sont également présents dans le plasma pour détoxifier et/ou transporter le LPS vers le foie (Fig. 3). Dans cette section, nous passons en revue les principaux mécanismes de détoxification du foie et décrivons les principales protéines de transport impliquées dans la clairance du LPS vers le foie.

Figure 3.Synthèse des mécanismes limitant l'entrée et la diffusion des LPS dans la circulation. Le microbiote intestinal est la principale source de LPS, et le site principal d'entrée du LPS se fait par l'intestin. La muqueuse intestinale fournit de nombreuses protéines [mucines, peptides antimicrobiens (AMP), phosphatase alcaline intestinale (IAP)] qui empêchent les bactéries porteuses de LPS ou LPS d'entrer en contact étroit avec la face apicale des cellules épithéliales intestinales ou qui détoxifient le LPS dans la muqueuse [acyloxyacyl hydrolase (AOAH), bactericidal permeability-increasing protein (BPI)]. Despite this mucosal gut barrier, LPS might reach the liver through the portal vein. The liver participates in LPS detoxification via 2 major processes: either detoxification of LPS through specific enzymes (AOAH) or alkaline phosphatase (ALP) or coexcretion with bile acids into the duodenum. Many plasma transport proteins, including lipopolysaccharide-binding protein (LBP), soluble cluster of differentiation 14 (sCD14), or lipoproteins, are also involved in the clearance of LPS to the liver.

The liver: the major LPS-detoxifying organ.

The major role of the liver is to take up nutrients from the portal vein and distribute them to the other organs. At the same time, the liver is continuously exposed to a variety of gut-derived antigens, bacteria, and endotoxins and has to clear these toxic components. The liver is structurally heterogeneous with parenchymal and nonparenchymal cells. Hepatocytes, parenchymal cells, represent the majority (60%) of the total liver cells, while nonparenchymal cells compose 40% of the liver cells including 15% of Kupffer cells, liver macrophages that reside in the lumen of the liver sinusoids. The liver is the major organ involved in LPS detoxification, although the mechanisms are not fully understood. In mice, 45% and 35% of a single intravenous injection of LPS (700 ng) is found in the liver after 5 and 60 min, respectively (32). Moreover, Mimura et al. showed that after intravenous injection of fluorochrome-labeled LPS fluorescence was found after 5 min in the hepatocytes and after 20 min in the bile (106). However, within the liver, LPS localization seems dynamic: during the first 5 min after portal injection radiolabeled LPS is found in Kupffer cells, and then it is redirected to hepatocytes and excreted into the bile (150) (Fig. 3). Despite the description of this dynamic process of LPS disposal, the precise mechanisms of transfer of LPS from Kupffer cells to hepatocytes and then to the bile are poorly described, although it clearly involves lipoproteins and apolipoprotein E (129, 130). Similarly, the cosecretion of LPS with bile acids seems to involve hydrophobic interactions of LPS with bile acids (57) before secretion into the duodenum (103, 106). Finally, besides disposal of LPS through bile secretion, the liver is also endowed with enzymes that detoxify LPS. As macrophages, Kupffer cells express the leukocyte AOAH that detoxifies LPS by deacetylation (137) after phagocytosis by SR (150). Hepatocytes also express a particular isoform of alkaline phosphatase that dephosphorylates the phosphate groups in positions 1 and 4, forming a nontoxic LPS molecule (124a).

Plasma LPS transport proteins.

Either in host biological fluids or in cells, LPS is mainly attached to binding proteins (31). In the plasma multiple proteins with various affinities (Table 1) have been described: LBP, sCD14, lipoproteins, BPI, adiponectin, serum amyloid P, lectins, gelsolin, and hemoglobin (30). The most LPS specific, LBP and sCD14, as well as lipoproteins that are involved in LPS detoxification are presented next.

LIPOPOLYSACCHARIDE-BINDING PROTEIN.

As already mentioned, LBP is an acute-phase protein synthesized by hepatocytes (82) and intestinal cells (157) in response to proinflammatory cytokines and released into the bloodstream. The concentration of LBP in healthy human serum ranges from 5 to 15 μg/l and exhibits a 30-fold increase 2–3 days after the onset of the acute phase of the inflammation reaction (135, 164). In an aqueous solution such as blood, the amphipathic LPS aggregates and binds poorly to immune cells. LBP facilitates LPS monomerization by inserting into aggregates, thereby helping LPS transfer to immune cells and degradation by these later (135). Second, LBP catalyzes the transfer of LPS to lipoproteins such as chylomicron or high-density lipoproteins (HDLs), promoting its clearance by the liver (156, 158). Nonetheless, at low concentration LBP potentiates LPS-induced inflammation by transferring LPS to the TLR4-MD2 complex (160).

SOLUBLE CD14.

CD14 exists in two forms: membrane CD14 (mCD14) and soluble CD14 (sCD14). As already mentioned, mCD14 binds LPS-LBP complexes, resulting in TLR4 activation. The soluble form is released by the phagocyte immune cells monocytes and macrophages and released into the bloodstream. In healthy individuals, sCD14 concentration in the blood is ∼2 mg/l (113) and increases during infection.

The binding affinity of sCD14 for LPS is moderate (Table 1) but enhanced by LBP (83). sCD14 has a dual role, either inhibiting or enhancing LPS cellular activation. It is able to transfer LPS either to mCD14 anchored to the membrane or directly to TLR4/MD2 complex when mCD14 is absent, thereby triggering LPS-induced TLR4 activation (83). However, sCD14 can also transfer free LPS or mCD14-bound LPS to lipoprotein, thus reducing LPS cellular stimulation (83). Like LBP, this dual sCD14 action is concentration dependent: at concentrations below physiological level sCD14 enhances LPS cellular activation, whereas it exhibits inhibiting effects at high concentrations (83).

PLASMA LIPOPROTEINS.

The primary function of plasma lipoproteins is lipid transport between tissues and organs, but they are also involved in LPS detoxification. All lipoprotein classes (very low-density lipoproteins, HDL, low-density proteins, and chylomicrons) bind LPS and reduce LPS-induced inflammation (69) (156). When incubated with human plasma, >90% of LPS is associated to lipoproteins, the majority (60%) with HDL (97). However, chylomicrons might have the most potent detoxifying effects (156). Transfer of LPS to the lipoprotein membrane is catalyzed by several plasma proteins such as phospholipid transfer protein or cholesteryl ester transfer protein. They mediate the exchange of LPS between micelles and help the transfer of LPS to lipoproteins only and not to TLR4/CD14 complexes (135).

Lipoproteins increase the clearance of LPS by formation of LPS-lipoprotein complexes preventing LPS binding to TLR4, thereby reducing cytokine secretion. Moreover, lipoproteins are able to take up LPS already bound to monocytes, reducing LPS-induced inflammation (84). When bound to lipoproteins, LPS is transferred to the liver, where it is excreted into the bile.


Presentation Transcript

What’s on a Pinpoint? • How many bacteria? • How many are needed to start an infection? • Sometimes as few as 10 bacteria are enough!

Historical Microscopy • Anton van Leeuwenhoek-1670’s • 1st to see micro-organisms • lens maker, simple scopes 100x to 300x • Single lens, like a magnifying glass • Studied “animalcules”

Principles of Microscopy • Metric units- powers of 10 • Microscopy- technology of making very small things visible to naked eye • Measurements in: - micrometers (microns) um 0.000001m= 10-6 m - nanometers nm= 10-9 m - angstroms- (A) 10-10 m

Properties of Light:Wavelength and Resolution • Wavelength- length of a light ray • Resolution- ability to see 2 objects as separate & discrete units (not fuzzy) • Visible light = 550nm (NG) • UV light= 100-400 nm better for resolution • Electron microscopy- .005 nm high reso • Resolving power of lens- numerical measure of lens, smaller distance from lens to slide =greater resolving power

Properties of Light:Light and Objects • Reflection-light strikes an object & bounces back • Transmission- light passes through object • Absorption- light rays taken up by object • Luminescence-absorbed UV rays are changed to longer wave & reemitted • Fluoresce- luminescence only occurring during irradiation • Phosphorescent- object emits light when light rays no longer strike it (some bacteria)

Properties of Light:Light and Objects • Refraction- bending of light as it passes from one medium to another • Index of refraction- measure of the speed at which light penetrates • Immersion oil- used for better resolution because oil as the same index of refraction as glass. • Diffraction- light waves bend around an opening and could cause blurry slides • Iimit = oil immersion with 10 x eyepiece=1000X

Light Microscopy and Types of Microscopes • Microscope that uses visible light to observe specimen • Hooke’s compound microscope had more than 1 lens • The Compound Light Microscope: - monocular- 1 eyepiece, binocular-2 • Survey of microscope parts and their functions – pg 58

Total Magnification Calculations • Scanning power -4x X 10x (ocular)= 40x • Low power 10x X 10x(ocular) = 100 x • High dry power 40x X 10 x = 400 X • Oil immersion 100x X 10 x = 1000x • Parfocal- in focus on one power, simple rotate nosepiece and its should focus on next power • Ocular micrometer- measure size of sample

Light Microscopy and Types of Microscopes • Dark-Field Microscopy- condenser causes light to reflect off specimen at an angle and increases the contrast • Phase-Contrast Microscopy-to observe live and unstained specimens by increasing refractive index and shows different degrees of brightness • Nomarski Microscopy- differential interference contrast and looks “3D”

Light Microscopy and Types of Microscopes • Flourescence- UV light is used to excite molecules, longer wavelengths= bright • Confocal Microscopy- usesbeams of UV lases light and computer reconstructs images, up to 40% better. Can study microbes alive or not. • Digital Microscopy-have built in digital camera and can be viewed on screen

Different Types of Electron Microscopy • EM uses electron beam and electro-magnets not lenses- high resolution • Photos taken – Electron micrographs • Transmission Electron Microscopy- (TEM) better view of internal structures up to 500,000x magnification - shadow casting- - freeze fracturing- - freeze etching-

Different Types of Electron Microscopy • Scanning Election Microscopy (SEM)- - Image of the surface “3D” 50,000x mag • Scanning Tunneling Microscopy (STM’s)- - 1980 can be used with liver specimens and under water • Atomic force microscope-(AFM)- advanced 3d from atomic size to 1 micron - used to study DNA, proteins

Techniques of Light Microscopy • Preparation of Specimens for the Light Microscope: • 1) Wet Mounts- drop of medium with microbes is spread on a slide • 2) Smears- microbes from a loopful of medium are spread on a slide, then heat fixed to kill microbes - heat fixation-

Principles of Staining • Stain- dye that binds to a cellular structure and gives it color • + charge-basic= methylene blue, crystal violet, safranin and malachite green • - charge-acidic= eosin and picric acid • Simple stain- single dye and reveals basic cell shapes and structures • Differential stain- 2 or more dyes: Gram stain, Ziehl-Neelsen acid fast and spore

Gram Stain • Gram Stain- 1884 crystal violet (+) and iodine and ethanol decolorizer, and counterstained with safranin (-) • Gram +=purple • Gram - = red • Gram non reactive= no stain • Gram Variable= stain unevenly

Special Staining Procedures • Ziehl-Neelsen Acid-Fast Stain - 1882 modification of Ehrlich staining method - Acid fast retain red color in cell walls • Negative staining-capsule is present and won’t take up stain • Flagellar staining- coats flagella so they can be seen • Endospore staining- Schaeffer-Fulton stain